单克隆抗体制备全攻略(二).pdfVIP

6、单抗特性的鉴定 ⑴单克隆性的确定包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定和 单抗纯度鉴定等。 A、杂交瘤细胞的染色体分析 对杂交瘤细胞进行染色体分析可获得其是否是真正的杂交瘤细胞的客观指标之一，杂交 瘤细胞的染色体数目应接近两种亲本细胞染色体数目的总和，正常小鼠脾细胞的染色体数目 为40，小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为62- 68，NS-1为54-64；同时骨髓瘤细胞的染色体结构上反映 两种亲本细胞的特点，除多数为端着丝点染色体外，还出现少数标志染色体。另一方面，杂 交瘤细胞的染色体分析对了解杂交瘤分泌单抗的能力有一定的意义，一般来说，杂交瘤细胞 染色体数目较多且较集中，其分泌能力则高，反之，其分泌单抗能力则低。 检查杂交瘤细胞染色体的方法最常用秋水仙素法，其原理是应用秋水仙素特异的破坏纺 锤丝而获得中期分裂相细胞；再用0.075mol/LKCl 溶液等低渗处理，使细胞膨胀，体积增大， 染色体松散；经甲醇-冰醋酸溶液固定，即可观察检查。其操作步骤如下： a.在加秋水仙素前48-36小时将杂交瘤细胞传代。 b.秋水仙素处理：在培养瓶中加入秋水仙素（100ug/ml，除菌，-20℃保存），使最终浓度为0.1- 0.4ug/ml（若改用秋水仙胺则最终浓度为0.02-0.05ug/ml）；继续培养4-6小时，然后吹打细胞， 移入离心管中，1000r/min 10分钟，弃上清。 c.加入已预温到37℃的0.075mol/LKCl 溶液5ml，将沉淀细胞悬浮并混匀，37℃水浴15-20分 钟。 d.向悬液中加入新配制的固定液（甲醇与冰醋酸3：1混合）1ml，混匀，然后1000r/min 10分 钟，弃去上清液；本步骤的目的是使细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘连成团块。 e.加入固定液5ml，将细胞悬浮并混匀，室温静置20-30分钟，然后1000r/min 10分钟，弃去上 清液；重复操作一次；其后加5ml固定液，将细胞悬浮并混匀，封上管口，置4℃过夜。 f.取出离心管，1000r/min 5分钟，轻轻吸去上清液，根据细胞压积多少而留下0.5-1ml 固定液， 将细胞悬浮并混匀后，吸取细胞悬液1-2滴，滴在刚从冰水中取出的载玻片上，用口吹散， 并在火焰上通过数次，使细胞平铺于载玻片上，自然干燥。 g.用新配制的10%Giemsa 染液染色10-20分钟，然后用自来水洗去染液，自然干燥。（Giemsa 染液配方：Giemsa 粉0.5g，甘油33ml，55-60℃保温2小时，加甲醇33ml 混匀，保存于棕色 瓶内作为原液；取原液1份，加1/15mol/L PH6.8PBS 9份，即成10%Giemsa 染液）。 h.镜检：选择染色体分散好，无重叠，无失散的细胞进行观察分析。每份标本应计数100个 完整的中期核细胞，并注意观察是否有标志染色体。 B、抗免疫球蛋白的类别和亚类鉴定 抗体的类和亚类对决定提纯的方法有很大的帮助。除采用特殊的免疫方法和检测方法， 最经常得到的单抗是IgM和IgG，分泌IgE的杂交瘤细胞很少见，而分泌IgA 的杂交瘤通常 只有在用于融合的淋巴细胞来自肠道相关淋巴组织才能得到。如在抗体检测中使用葡萄球菌 A 蛋白试剂，则不可能得到IgG以外的其他类的抗体。鉴定单抗 Ig类和亚类的方法主要有 两种，一种是免疫扩散，另一种是ELISA。 （A）免疫扩散法 这种方法简便、准确，最常用。被检的 McAb样品通常为杂交瘤细胞培养上清液，由 于其中单抗的浓度较低，应先将其浓缩10-20倍左右再检测。小鼠腹水中的单抗浓度虽很高， 但也含有小鼠本身的各类 Ig，它们也会与相应抗血清发生反应，使鉴定结果出现混乱，即 使将腹水稀释10-20倍后再检测也不能完全避免上述情况的发生，因此一般不用腹水型单抗 作为被检样品。 材料： a.小鼠IgG 及其亚类IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM、IgA的抗血清。 b.0.06mol/L巴比妥钠-盐酸缓冲液（PH8.6）。 c.1%琼脂糖凝胶：1g 琼脂糖加入100ml 0.06ml/LPH8.6巴比妥钠-盐酸缓冲液中，隔水煮沸 溶解，加0.02%NaN3防腐，4℃保存备用。 d.洁净载玻片，打孔器（直径3mm），湿盒，酒精灯。 方法： a.杂交瘤细胞培养上清液的浓缩：取该上清液10ml 装入透析袋中，用线扎紧，放在小烧杯中， 透析袋周围堆置PEG6000或蔗糖或PVP（聚乙烯吡咯烷酮polyvinylpyrrolidone），放于4℃数 小时，待透析袋内液体量浓缩至约0.5-1ml 时，吸出，可于-20℃保存备用；也可采用吹风