水中大肠杆菌的检测方法.docVIP

附件 水中大肠杆菌群检测方法－多管发酵法 NIEA E201.54B 一、 方法概要 本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生内生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在35 ± 1 ℃、48 ± 3小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群（Coliform group）；在不同体积或不同稀释度之水样所产生之结果，以「100 mL水中最大可能数（MPN/100 mL）」表示 100 mL水中存在之大肠杆菌群数目。 二、 适用范围 本方法适用地面水体、地下水体、废水、污水及水源水质水样中大肠杆菌群之检验。 三、 干扰 (一) 水样中含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长之物质。 (二) 检测使用的玻璃器皿及设备含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长的物质。 四、 设备 (一) 量筒：100至1000 mL之量筒。 (二) 吸管：有0.1刻度之10 mL灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管，或无菌微量吸管（micropipet）。 (三) 试管：大小约150 × 15 mm之试管或有盖螺旋试管。 (四) 发酵管（fermentation tube）：大小约22 × 9 mm之玻璃管。 (五) 稀释瓶：容量约100 mL可灭菌之硼硅玻璃制品。 (六) 锥形瓶：200至2000 mL之可灭菌硼硅玻璃制品。 (七) 采样容器：容量120 mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。 (八) 冰箱：温度能保持在4 ± 2℃者。 (九) 天平：待测物重量大于2 g时，须能精秤至0.01 g；待测物重量不大于2 g时，须能精秤至0.001 g。 (十) 培养箱：温度能保持在35 ± 1℃者。 (十一) 高压灭菌釜：温度能维持在 121℃（压力约15 lb/in2 或 1.1 Kg/cm2）灭菌15分钟以上者。 (十二) 高温干热烘箱：如用于玻璃器皿等用具之灭菌，温度须能保持在 160℃达2小时或170℃达1小时以上者。 (十三) 接种环：为白金或镍铬合金制，适用于细菌接种或移植，亦可使用无菌塑料制品。 (十四) pH计：精确度达0.1 pH单位。 五、 试剂 (一) 试剂水：蒸馏水或去离子水，导电度在 25 ℃时小于2 μ mho / cm（μS / cm）。 (二) 培养基，应使用市售商品化培养基。 １、 硫酸月桂酸胰化蛋白胨培养基（Lauryl sulfate tryptose broth，简称LST） 　　 1倍浓度LST培养基含有下列成份： 胰化蛋白胨（Tryptose） 　　　　　　　　　20.0g 乳糖（Lactose） 　　　　　　　　　　　　　5.0g 氯化钠（NaCl） 　 　　　　　　　　　　　　5.0g 磷酸氢二钾（K2HPO4） 　 　　　　　　　　2.75g 磷酸二氢钾（KH2PO4） 　 　　　　　　　　2.75g 硫酸月桂酸钠（Sodium lauryl sulfate） 　　　　0.1g 试剂水 　　　　　　　　　　　　　　　　　　1L 　　　　配成2倍浓度（取71.2 g LST培养基粉末溶于1 L试剂水），完全溶解后，分取10 mL注入装有倒置发酵管之试管内，经121℃灭菌15分钟，冷却后备用，灭菌后培养基之pH值应在 6.8 ± 0.2。灭菌后培养基若未当日使用，应保存在4 ± 2℃，保存期限为14天。可根据检验需求量，依配方配制培养基。 ２、 煌绿乳糖胆汁培养基（Brilliant green lactose bile broth，简称BGLB） 　　 1公升的BGLB 培养基中含有下列成份： 蛋白胨（Peptone） 　　　　　　　　　　　　10.0g 乳糖（Lactose） 　　　　　　　　　　　　　10.0g 牛胆粉（Oxgall Powder） 　　　　　　　　　　20.0g 煌绿色试剂（Brilliant Green） 　 　　　　　　0.0133g 试剂水 　 　　　　　　　　　　　　　　　　　1L 　　　　取40 g BGLB培养基粉末溶于1 L试剂水，完全溶解后，分取5至10 mL注入装有倒置发酵管之试管内，经121℃灭菌15分钟，冷却后备用，其pH值应在7.2 ± 0.2。灭菌后培养基若未当日使用，应保存在4 ± 2℃，保存期限为14天。可根据检验需求量，依配方配制培养基。 (三) 无菌稀释液 １、 磷酸二氢钾储备溶液 　　　　取3.4 g磷酸二氢钾（KH2PO4）溶于50 mL的试剂水中，俟完全溶解后，以1.0 N NaOH 溶液调节其pH值为7.2 ±0.1，然后加试剂水至100 mL，灭菌（过滤灭菌或121 ℃高温高压灭菌15分钟）后储存于冰箱中备用。4 ± 2 ℃下保存期限为3个月。 ２、 氯化镁储备溶液 　　　　取8.1 g氯化镁（MgCl2?6H2O），先溶于少量试剂水，俟完全溶解