家蚕Flap+Endonuclease-1基因克隆及功能研究.pdf

摘要 家蚕Flap 及功能研究 细胞生物学专业硕士研究生：杜娟 指导教师：潘敏慧教授 鲁成教授 摘要 家蚕属于完全变态昆虫，经过卵、幼虫、蛹和成虫四大形态和机能完全不同的发育阶段， 必然有大量凋亡基因参与家蚕发育变态。目前，细胞凋亡的研究对象主要集中在人类、小鼠、 线虫和果蝇等模式生物中。家蚕作为重要的经济昆虫，其凋亡相关研究尚处于起步阶段。自 1994年成功克隆鼠核酸内切酶陋Ⅳ-j(nap 母等物种的FEN-1基因的功能和结构进行了一系列的深入研究，普遍认为：正常情况下，FEN-1 参与DNA的复制和修复，维持基因组的稳定性和DAN复制的精确性。但是用’Ⅳ：j对细胞凋亡、 癌症形成也有重要作用。关于FEN-1怎样使基因组从稳定到破坏的分子机制是一项非常有趣的 研究。本研究以家蚕胚胎细胞BmE．SWUl为实验材料，克隆了家蚕陋Ⅳ．J基因，初步研究了该 基因的功能，获得了以下研究结果： 1 BmFEN-1基因的克隆与信息分析 利用家蚕EST数据，根据拼接结果设计引物，成功克隆了家蚕BmFEN-1基因。该基因 cDNA长为1343 143 bp，ORF长1 该基因具有8个外显子和7个内含子，外显子／内含子边界处均符合GT-AG规则。用在线 白质序列比对分析表明，BmFEN-I编码的蛋白质序列与人、老鼠、果蝇和伊蚊的蛋白序列相 似性较高，分别为61％、63％、72％和74％。 2 UVB诱导家蚕BmE．SWUl细胞凋亡 两南大学硕h学佗论文 蚕BmE．SWUl细胞后，细胞增殖活性随着照射剂量的增加而逐渐降低；光镜下可见细胞膜表 面突出或形成小泡，细胞破裂成凋亡小体。UVB处理24h后，细胞几乎全部破裂成凋亡小体。 经Hoechst染色后，凋亡小体在荧光显微镜下清晰可见，细胞DNA电泳条带呈梯形分布，这是 凋亡细胞典型的生化特征。 3 BmFEN-J基因功能的初步研究 转染后正常培养48h，用以下三种方法进行检查。MTr检查显示干涉组的胚胎细胞的增殖受 到明显抑制，存活率为对照组的80％。PI染色后，经流式细胞仪检查细胞周期，干涉组S期 色后，经流式细胞仪检查凋亡情况，结果显示：干涉组凋亡率为35．03％，远高于对照组0．99％ 的凋亡率。经荧光定量PCR检测BmFEN-1基因的表达，扩增结果表明，转染组的基因表达量 的表达量明显降低，将会抑制家蚕胚胎细胞系的增殖，导致细胞阻滞于S期，并出现明显的凋 亡。 Endonuclease-1RNA干扰 关键词：家蚕细胞凋亡Flap Il Abstract of Endonuclease—jin andFunctionthe Gene Cloning Flap mori Silkworm，Bombyx Biology Discipline：Cell MasterCandidate：DUJuan Min-Hui Supervisor：Prof．Pan Prof．Lu Cheng Abstract