脱氧雪腐镰刀菌烯醇对人正常食管鳞状上皮细胞抗原提呈相关分子及凋亡影响实验研究.pdf

中文摘要 脱氧雪腐镰刀菌烯醇对人正常食管鳞状上皮细胞抗 原提呈相关分子及凋亡影响的实验研究 摘 要 素，在全世界的粮食和饲料的污染均非常普遍，联合国粮农 的自然发生食品污染物之一，并列入国际研究的优先地位。 研究表明，DON是我国食管癌高发区居民粮食的主要污 染霉菌毒素之一。虽然DON毒性较其它真菌毒素小，但因 其对谷物的污染率和污染水平居镰刀菌毒素之首，同时DON 常与其他真菌毒素共存，被食入后可以共同作用于人体，对 人类健康造成了很大的威胁。DON具有广泛的细胞毒性，可 以抑制大分子的合成，促进免疫细胞凋亡并抑制其增殖，同 时抑制或超诱导多种细胞因子的分泌，影响细胞内多种激酶 的活性，总体上对机体的免疫功能产生不利的影响。近年来 的研究发现，DON可能与人类食管癌、IgA肾病、克山病和 大骨节病有关。 众所周知，恶性肿瘤的发生除致癌物的直接作用外，机 体的免疫状态也发挥着非常重要的作用。HLA．abe分子的正 常表达是维持机体抗体抗肿瘤免疫效应的重要化环节。研究 表明，许多人类肿瘤中可见HLA．abc分子的失表达和低表达 现象。本研究组以往的研究发现，DON可诱导小鼠胸腺细胞 和人外周血单个核细胞的凋亡，同时DON抑制外周血单个 中文摘要 核细胞抗原提呈分子的表达。因此，认为细胞HLA．abc分子 表达降低，可能有助于细胞逃避免疫监视，使癌变发生成为 可能。但有关DON对食管鳞状上皮细胞直接作用的研究， 国内外尚未见文献报道。 本研究运用细胞培养，免疫细胞化学，流式细胞定量检 测，Western 24小时后，原代培养的正常食管鳞状上皮细胞HLA．abe、 检测了细胞凋亡，探讨分析了DON对正常食管鳞状上皮细 胞抗原提呈分子的影响规律和对细胞凋亡的可能影响。从免 疫角度探讨DON对机体免疫功能的可能影响，初步揭示 DON暴露在我国食管癌高发区肿瘤发生发展中的可能作用。 方法： l成人食管鳞状上皮细胞原代培养 将取材的正常食管粘膜，在无菌条件下反复冲洗。置于 1640培养液中，尽量剪除粘膜下血管和结缔组织，将粘膜剪 成2mm2左右的小块。置于涂布胎牛血清的培养瓶中，粘膜 面均朝上，加入少量DMEM：F12(1：1)混合培养基， 使组织块湿润，在48小时内将瓶中的培养基加到2ml。37℃ 5％C02的培养箱培养。以后每2—3天换液一次。21天上皮 细胞可布满瓶底。 2食管鳞状上皮细胞的鉴定 倒置显微镜下观察细胞细胞形态和生长情况，细胞爬片 后用广谱CK进行免疫细胞化学染色，鉴定细胞来源。 3实验分组与处理 当食管上皮细胞晕相互融合，细胞生长铺满大部分瓶底 中文摘要 时，随机分为处理组和对照组。处理组加DON(1mg／m1) 的生理盐水。作用24h后常规刮匙刮除细胞并离心收集，或 细胞爬片后检测各指标表达情况。 4细胞总RNA的提取、鉴定及定量 采用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA。1％琼脂糖电 泳鉴定其完整性。紫外分光光度计进行定量。 5RT-PCR 琼脂糖凝胶电泳90V 行定量分析。 6细胞总蛋白的提取和定量 应用预冷的细胞裂解液加入收集的细胞中，提取细胞总 蛋白。将提取的蛋白应用紫外分光光度计进行定量。 7蛋白印迹(WestemBlotting) X线胶片感光将结果记录下来，扫描后再经BiolD图像分析系 统对杂交条带进行定量分析。 8免疫细胞化学染色 细胞爬片后，采用免疫细胞化学SP法，严格按照操作 说明进行，DAB显色，显微镜下观察。 9FCM检测 分别收集各组细胞，PBS洗涤，离心收集细胞，一部分 用70％乙醇固定检测细胞凋亡情况；另一部分用2％甲醛固 定流式细胞定量分析HLA．abc表达情况。 中文摘要 10统计分析 各项数据均以均数士标准差(x士s)表示，采用SPSSl3．0 统计软件进行单因素方差分析，用SNK法进行两两比较， 量效关系采用相关回归分析。 结果： 1原代培养的人正常食管上皮细胞的形态学观察和鉴定 DMEM．．F12混合培养基中的组织块在5天后有细胞长 出。细胞成卵圆形和多角形，胞质