SmallRNA问题大集合.docVIP

Small RNA问题大集合 Small RNA是一大类调控分子，几乎存在于所有的生物体中。Small RNA包括：miRNA、ncRNA、siRNA、snoRNA、piRNA、rasiRNA等等。Small RNA通过多种多样的作用途径，包括mRNA降解、翻译抑制、异染色质形成以及DNA去除，来调控生物体的生长发育和疾病发生。Small RNA转录组测序是鉴定和定量解析small RNA的新方法和有力工具。 Roche GS FLXTitanium 、IlluminaHiseq2000和AB SOLID 4均可以对SmallRNA进行大规模测序分析，Illumina Hiseq2000 和ABI Solid的读长正好配合了small RNA的短序列且通量大，可以得到更高的覆盖率，Illumina Hiseq2000在small RNA测序中广泛应用。 通过对Small RNA大规模测序分析，可以从中获得物种全基因组水平的Small RNA图谱，实现包括新Small RNA分子的挖掘，其作用靶基因的预测和鉴定、样品间差异表达分析、Small RNA聚类和表达谱分析等科学应用。 Small RNA测序有什么样的样品要求？ 答： (1) 样品纯度要求： OD值应在1.8至2.2之间；电泳检测28S:18S至少大于1.5。 (2) 样品浓度： total RNA浓度不低于200 ng/μL，提取总RNA时请不要使用过柱法提取总RNA，样品总量不低于20 μg (SmallRNA: total RNA大于0.3%)。或提供浓度大于20ng/μL，总量大于1μg的Small RNA样品。 (3) Small RNA样品请置于-20℃保存；请提供Small RNA样品具体浓度、体积、制备时间、溶剂名称及物种来源。请同时附上QC数据，包括电泳胶图、分光光度或Nanodrop仪器检测数据。如需进行多次样品制备，需要提供多次样品制备所需样品 (4) 样品运输：样品请置于1.5 ml管中，管上注明样品名称、浓度以及制备时间，管口使用Parafilm封口。建议使用干冰运输，并且尽量选用较快的邮递方式，以降低运输过程中样品降解的可能性。 Small RNA分离的方法？ 答：现行的RNA纯化方法包括有机溶剂抽提+乙醇沉淀，或者是采用更加方便快捷的硅胶膜离心柱的方法来纯化RNA。由于硅胶膜离心柱通常只富集较大分子的RNA(200 nt以上)，Small RNA往往被淘汰掉，因而不适用于Small RNA的分离纯化。有机溶剂抽提能够较好的保留Small RNA，但是后继的沉淀步骤比较费时费力。目前还有另外一些Small RNA分离专用的试剂盒。如MirVana miRNA IsolationKit是采用玻璃纤维滤膜离心柱(glass fiber filter，GFF)，既能够富集10 mer以上的RNA分子，又兼备离心柱快速离心纯化的特点。 对于Small RNA测序，我们采用PAGE胶电泳对小RNA进行分离。客户可以选择他们感兴趣的Small RNA长度进行研究。Small RNA的长度为18-30nt。我们推荐的测序长度为35bp，之后对序列信息进行修剪，去除接头序列仅留下Small RNA序列。 Small RNA测序文库的构建方法及质量控制？ 答： 由于Illumina Hiseq2000的读长足够满足Small RNA测序的读长要求，且数据读取量大，性价比高，因此Illumina Hiseq2000在Small RNA测序方面得到广泛的应用。采用Illumina Hiseq2000进行Small RNA测序其文库构建方法如下 (1) PAGE胶纯化特定大小的小RNA分子； (2) 5′接头连接和纯化； (3) 3′接头连接纯化； (4) RT-PCR扩增； (5) Small RNA文库的纯化； (6) 文库的检测。Small RNA文库需要通过电泳检测和Agilent Technoligies 2100 分析仪检测以分析测序文库中片段的大小、纯度和浓度。 采用Illumina Hiseq2000进行Small RNA测序时Read/Tag的长度是多少？推荐的覆盖深度是多少？ 答：对于Small RNA测序，客户可以选择他们感兴趣的Small RNA长度进行研究。Small RNA的长度为18-30nt。针对Illumina Hiseq2000我们推荐的测序长度为35 bp，之后对序列信息进行修剪，去除接头序列仅留下Small RNA序列。对于Small RNA发现和分析的研究，由于需要对Small RNA进行表达分析，因此测序过程中我们不推荐覆盖深度(Depth ofCoverage)。一般每个样本至少获取500万条读数(read)，信息量