His-蛋白纯化步骤.docVIP

原核蛋白表达 将pET14b RXL BL21菌在Kan+ LB平板上划线，放置37℃培养箱中培养。 挑取单克隆入2～4ml Kan+ LB液体培养基中，置37℃摇床中培养过夜。 将摇起的菌液以1:100接种量转接入Kan+ LB液体培养基，置37℃摇床中培养2小时30分钟，后加入终浓度1mM IPTG置37℃摇床中诱导3～4小时。 His-CyclinE在BL21中的表达 将CyclinE以EcoR I 与XhoI双酶切构建到pET32a(+)上, 转化BL21, 后接菌摇菌过夜, 后以1:100转接到新鲜的LB培养基; 37℃摇菌2小时 30 分钟后, 加入IPTG至终浓度0.6mM, 37℃诱导4小时, 5000rpm×10min离心收菌; 菌体用PBS洗涤一次, 后加入超声液(20mM Na2HPO4, 0.5M NaCl, 10mM imidazole, 1 mM PMSF), 重悬, 后以5s, 间隔10s, 全程时间20min, 保护温度8℃超声; 12000rpm×20min×4℃离心, 后进行His蛋白纯化. His-蛋白纯化步骤 Ni-NTA Beads的再生过程: 用2倍柱体积的Regeneration Buffer( 6M 盐酸胍, 0.2M 醋酸)洗涤Beads; 用5倍柱体积的水洗涤; 用3倍柱体积的2％SDS洗涤; 用1倍柱体积的25％乙醇洗涤; 用1倍柱体积的50％乙醇洗涤; 用1倍柱体积的75％乙醇洗涤; 用5倍柱体积的100％乙醇洗涤; 用1倍柱体积的75％乙醇洗涤; 用1倍柱体积的50％乙醇洗涤; 用1倍柱体积的25％乙醇洗涤; 用1倍柱体积的水洗涤; 用5倍柱体积的100Mm EDTA, pH8.0洗涤10min(鳌合除去多余的Ni离子); 用5倍柱体积的水洗涤; 用2倍柱体积的100mM NiSO4室温结合30min; 用5倍柱体积的水洗涤; 用2倍柱体积的Regeneration Buffer; 用2倍柱体积Binding Buffer平衡. 备注: 新Beads可以从13步开始 His-蛋白纯化过程: 将His-CyclinE上清加入Ni-NTA Beads中, 4℃结合2小时, 后打开盖子, 让 液体流下; 加入5倍柱体积的Washing Buffer在混合器上洗涤10min, 后打开盖子, 让 液体流下,此步骤重复3-4次; 后分别用1 mL 50mM, 75mM, 100mM, 125mM, 150mM的Elution Buffer 进行梯度洗脱; 结果显示在125mM imidazole 洗脱蛋白比较纯. 各种试剂的配方 Binding Buffer: 20mM Na2HPO4, 0.5M NaCl, 10mM imidazole, pH7.4 Washing Buffer: 20mM Na2HPO4, 0.5M NaCl, 20mM imidazole, 2％TritonX-100, pH7.4 Elution Buffer: 20mM Na2HPO4, 0.5M NaCl, 500mM imidazole, pH7.4 Regeneration Buffer: 6M 盐酸胍, 0.2M 醋酸 备注: 由于加入imidazole溶液的pH升高至碱性, 故pH须回调至7.4