Western印迹检测表达蛋白质.docVIP

准备以下试剂： 1X SDS加样缓冲液。50 mmol/L Tris·HCl（pH6.8），100 mmol/L 二硫苏糖醇，2%（W/V）SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油。 2，转移缓冲液。48 mmol/L Tris·HCl，39 mmol/L甘氨酸，0.037%（W/V）SDS。 3，封闭液。1%（W/V）去脂奶粉，溶于PBS中，0.01% antifoam A, 0.02%叠氮钠。 4， 碱性磷酸酶缓冲液。100 mmol?/L NaCl，5 mmol?/L MgCl2 ，100 mmol?/L Tris·HCl（pH9.5）。 5，NBT溶液。取0.5g NBT溶于10 ml 70%的二甲基甲酰胺。 6，BCIP溶液。取0.5g BCIP溶于10 ml 100%的二甲基甲酰胺。 哺乳细胞的裂解 用PBS洗2次细胞，加1X SDS加样缓冲液至培养皿中，用橡胶刮子刮下细胞，将细胞裂解液吸入一微量离心管中。 沸水煮5~10分钟。 用超声波打碎染色体DNA，直至溶液不黏为止。 室温离心10分钟，10000 r/min，取上清至1个新的离心管中。 测定蛋白质的浓度。Western 印迹检测蛋白质的敏感性为1~5ng，0.75 mm 厚的SDS-聚丙烯酰胺凝胶的一个孔大约能上100ug 的总蛋白质。所以，只要被检蛋白质占总蛋白量的1/105，即可被检测出来。 对细胞抽提液进行SDS分析。 蛋白质的电转移 目前在Western 印迹中，作为蛋白质转移的固定支持物最常用的还是硝酸纤维素膜，它与蛋白质以共价键结合，结合能力为80ug/cm2，不要预先活化，对转移物质生物活性影响较小，能应用多种阳离子染料染色，非特异性的显色浅，来源比较方便，价格也比较低。 操作过程： 剪6块Western 3MM 滤纸和一块硝酸纤维素膜，其大小应与SDS-凝胶的大小相同。注意：当用手触摸胶，Western 3MM滤纸及硝酸纤维素膜时均应戴手套，因为皮肤上的油和分泌物会影响蛋白质从胶上转移到膜上。 将剪好的Western 3MM滤纸及硝酸纤维素膜在转移缓冲液中浸泡3~5分钟。 按程序安装转移装置。 将塑料支架平放在含有转移缓冲液的托盘中，在塑料支架上放一块海绵。 依次放置纤维素膜、凝胶，另外3块Western 3MM 滤纸及海绵，在放置每一层时，均要去除它们之间的气泡，若有气泡残留，则影响转移效果。 最后用塑料支架加紧上述各层，放入电转移槽内，注意纤维素膜一侧靠正极，胶一侧靠负极。 接通电源，电压40V 电流0.17~0.2A，转移1.5~6小时，转移时间可根据靶蛋白的大小来定，蛋白质分子质量小则需时短，蛋白质分子质量大则需时长。 转移结束后，取出塑料支架，依次去掉各层，用铅笔在膜的上缘做好标记，切下其中一个孔所对应膜的1/2，用氨基黑染色30秒，10%乙酸脱色，检查转移是否完全；也可将转移后的凝胶做考马斯亮蓝染色来检查转移效果。 将其余的纤维素膜放在一张干净的Western 3MM滤纸上，室温下干燥30~60分钟。 封闭 将硝酸纤维素膜放在一平皿中，加封闭液（其量为浸过膜即可）。室温下轻轻振荡2~3小时。 靶蛋白与第一抗体反应 第一抗体溶液的配制：用封闭液稀释第一抗体。下列数值客座参考： 多克隆抗体：1：100~1：5000；培养的杂交瘤细胞上清液：可稀释到1：100；小鼠腹水：1：1000~1：10000。 封闭结束后，将纤维素膜放入一塑料袋中，按每平方厘米膜加0.1 ml第一抗体溶液，去除袋内的所有气泡，用封膜机封上开口，4℃下轻轻振荡2小时。 剪开塑料袋，弃去反应液，用PBS洗3次，每次10分钟。 与第二抗体反应 一般所用的第二抗体（抗免疫球蛋白或蛋白质A）为酶标抗体，如辣根过氧化物酶标抗体或碱性磷酸酶标抗体。 将膜从PBS中转入150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris·HCl（pH7.5）的溶液中，室温下轻轻振荡10分钟。去除纤维素膜上的磷酸及叠氮钠。 将膜放入一塑料袋中，加第二抗体溶液，每平方厘米膜加0.1 ml。 第二抗体溶液： 将酶标抗体用下述溶液稀释：1%（W/V）脱脂奶粉，150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris·HCl（pH7.5）。 第二抗体的稀释度一般为1：200~1：2000。 封好塑料袋，在室温下轻轻振荡1小时。 取出纤维素膜于150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris·HCl（pH7.5）溶液中冲洗3~5次，每次10分钟。 显色 于10 ml 碱性磷酸酶缓冲液中加66 ul NBT液，充分混匀，再加33 ul BCIP液，混匀。这一混合液必须在30分钟内使用。 将膜放入上述显色液中，室温下轻轻摇动。 注意观察显色反应，当条带达到所需深度（约20分钟）时，将膜转入5