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ELISA法测定饲料中的三聚氰胺 应化1007 张忆雪 2010016200 摘要:近年来，化工原料被用作食品添加剂的情况越来越多，动物的饲料中也被发现有有毒物质三聚氰胺的存在。目前国内检测三聚氰胺的方法主要是高效液相色谱法，确诊方法是气质联用法。但是，这两种方法比较复杂、耗时，而且检测成本较高，浪费大量的人力物力。而采用酶联免疫吸附法则比较简单快速，可以节约较多的资源。本文详细介绍了使用酶联免疫吸附法（ELISA）测定饲料中的三聚氰胺的具体实验方法。 关键词：三聚氰胺 酶联免疫吸附法 饲料 三聚氰胺（Melamine）（化学式：C3H6N6），俗称密胺、蛋白精，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，被用作化工原料。它是白色晶体，几乎无味，微溶于可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶水，。三聚氰胺对身体有害，不可用于食品加工或食品添加物。，因为每个三聚氰胺分子中都含有6个氮原子。而在原料的粗蛋白质检测过程中。用浓硫酸消化这一过程可以将三聚氰胺分解掉，这样在最后计算氮含量时，三聚氰胺中的氮原子即可拉高饲料氮的比率，造成蛋白质含量虚假增高。把三聚氰胺添加到饲料中的最大“好处”，就是可以冒充蛋白质，少量添加即可大大提高饲料氮含量。 三聚氰胺事件的起源是美国的几起宠物食品致猫狗死亡事件，促使美国开始深入调查事件背后的原因。根据调杳结果，在回收的宠物食品、死亡动物的尿液结晶和肾脏细胞中都发现有三聚氰胺。虽然还不能确定三聚氰胺在动物体内到底会产生怎样负面的影响，但是这种化工原料在饲料原料中出现显然是违规的。而在国内动物饲料的调查中，也存在三聚氰胺在饲料中含量超标的情况。 1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。再使用酶标仪测定待测样品吸光度与标准样品的吸光度变化对比值，即可定量测出待测物质在待测样品中的含量。 在进行实验时需要使用酶联免疫吸附法专用试剂盒，按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存，以防止受潮。 1材料与方法 1．1仪器:电子天平(感量0．000 1 g),小型粉碎机：Foss 1093(Sweden cyclotechTM带20目筛片)。分样筛：内孔径O．995 mm(20目)。微量可调移液器及吸头：50μl、20—250μl(八通道)、100—l 000μl。酶联免疫检测仪：含有波长450 nm的滤光片(DNM一9602酶标分析仪)。电动振荡器：GFL一3005(Gerrnany)。 1．2试剂:三聚氰胺定量检测试剂盒(Melamine Plate Kit),20 mmoL／L PBS：o．62 g NaH2P04·2H20+5．73 g Na2HP04·12H20+9 g NaCl，蒸馏水定容至l 000 ml。清洗液：0.62 g NaH2P04·2H20+5．73 gNa2HP04·12H20+9 g Nacl，蒸馏水定容至l000 ml+0.5ml吐温20 1．3材料饲料样品：阳性样品(使用高效液相色谱法检测并经过气相色谱质谱法确认的得出的结果的样品)，阴性样品。b为已知空白样品，A0为阳性添加。三聚氰胺标准品 1．4标准溶液的配制标准贮备液：称取三聚氰胺标准品100 mg(精确到0．1 mg)用20％甲醇溶液溶解并定容于100 ml容量瓶中，该溶液为l mg／ml，于4℃冰箱内贮存，有效期为3个月。标准工作液：吸取标准贮备液10．00 ml于100 ml容量瓶中，用20％甲醇溶液定容至100，该溶液即为100μg/ml标准工作液，临用时现配。 1．5加标样品的制备:取1．0 g空白试样，加100μg／ml标准使用液500μl