干扰素活性测定法.docVIP

附录 干扰素生物学活性测定法 (细胞病变抑制法) 本法系依据干扰素可以保护人羊膜细胞（WISH）免受水泡性口炎病毒（VSV）破坏的作用，用结晶紫对存活的WISH细胞染色，于波长570nm处测定其吸光度，可得到干扰素对WISH细胞的保护效应曲线，以此测定干扰素生物学活性。 试剂 （1）MEM或RPMI 1640 培养液取MEM或RPMI 1640 培养基粉末1袋（规格为1L），加水溶解并稀释至1000ml，加青霉素105IU和链霉素105IU，再加碳酸氢钠2.1g，溶解后，混匀，除菌过滤，4℃保存。 （2）完全培养液量取新生牛血清10ml，加MEM或RPMI 1640培养液90ml。4℃保存。 （3）测定培养液量取新生牛血清7ml，加MEM或RPMI 1640培养液93ml。4℃保存。 （4）攻毒培养液量取新生牛血清3ml，加MEM或RPMI 1640培养液97ml。4℃保存。 （5）消化液取乙二胺四乙酸二钠0.2g、氯化钠8.0g、氯化钾０.2g、磷酸氢二钠1.152g、磷酸二氢钾0.2g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃ 15分钟灭菌。 （6）染色液取结晶紫50mg，加无水乙醇20ml溶解后，加水稀释至100ml，即得。 （7）脱色液取无水乙醇50ml、乙酸0.1ml，加水稀释至100ml。 （8）PBS取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃ 15分钟灭菌。 标准品溶液的制备 取人干扰素生物学活性测定的国家标准品，按说明书复溶后，用测定培养液稀释至每1ml含1000IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。在无菌条件下操作。 供试品溶液的制备 将供试品按标示量溶解后，用测定培养液稀释成每1ml约含1000IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2个孔。在无菌条件下操作。 测定法 使WISH细胞在培养基中贴壁生长。按1︰2～1︰4传代，每周2～3次，于完全培养液中生长。取培养的细胞弃去培养液，用PBS洗2次后消化和收集细胞，用完全培养液配制成每1ml 含2.5×105～3.5×105个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl。于37℃、5%二氧化碳条件下培养4～6小时。将配制完成的标准品溶液和供试品溶液移入接种WISH细胞的培养板中，每孔加入100μl。于37℃、5%二氧化碳条件下培养18～24小时。弃去细胞培养板中的上清液。将保存的水泡性口炎病毒（VSV，－70℃保存）用攻毒培养液稀释至约100CCID50，每孔100μl。于37℃、5%二氧化碳培养24小时（镜检标准品溶液的50%病变点在1IU/ml）。然后弃去细胞培养板中的上清液，每孔加入染色液50μl，室温放置30分钟后，用流水小心冲去染色液，并吸干残留水分，每孔加入脱色液100μl，室温放置3～5分钟。混匀后，用酶标仪以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。 试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并按下式计算试验结果 供试品生物学活性（IU/ml）=Pr×Ds×Es Dr×Er 式中Pr为标准品生物学活性，IU/ml； Ds为供试品预稀释倍数； Dr为标准品预稀释倍数； Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数； Er为标准品半效稀释倍数。