膜片钳的发展与应用.docVIP

膜片钳技术的发展与应用 崔梦梦 （生命科学学院 1241410026） 摘要：膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来的，该技术的核心是能够记录单一离子通道的电流。膜片钳可以测量到0.06pA的电流，它具有1um的空间分辨率和10us的时间分辨率。作为先进的细胞电生理技术，膜片钳一直被奉为研究离子通道的“金标准”。应用膜片钳技术可以证实细胞膜上离子通道的存在并能对其电生理特性、分子结构、药物作用机稍等进行深入的研究。此外，将膜片钳技术与其他一些先进的技术结合，使其在药理学、病理学、神经科学、脑科学、细胞生物学和分子生物学等生物科学方面,，得到了越来越广泛的应用。 关键词：膜片钳；离子通道；发展与应用 在细胞膜上存在有许多的离子通道，这些离子通道是细胞兴奋性的基础，对细胞内以及细胞之间的信息传递起着非常重要的作用。为探究离子通道的功能和结构，许多电生理技术被发明创造。英国学者Huxley和Katz最早应用电压钳来研究细胞膜上离子通道的电流变化，但由于该技术钳制的细胞膜面积很大，包含着大量随机开放和关闭着的离子通道，因而不能测定单一离子通道电流。所以在1976年德国神经生物学家Erwin Neher和Bert Sakmann建立起一种新的技术，即膜片钳技术，并且逐渐取代了电压钳技术。 随着膜片钳技术的不断完善，自1981年以来, 该技术已经在不同动物的肝、脾、胃肠、心肌、骨骼肌、神经系统、内分泌等各类细胞上应用并取得了研究成果。膜片钳技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。 一、膜片钳技术的基本原理 膜片钳技术是利用玻璃微电极尖端经抛光后贴附于神经元膜上，与玻璃微电极尖端相接的膜仅含1—3个离子通道，然后通过负压吸引将这片膜与周围的膜实行高阻封接，因此在电极尖端覆盖下的那片膜，在电学上已于膜的其他部分相互分隔。电极尖端下的膜通道开放所产生的电流流进玻璃微电极吸管，通过一极其敏感的膜片钳放大器，就可测量得到单一离子通道电流。电极尖端的直径一般可达0.5um，它与膜的高阻封接可达到10亿欧，因而极大提高了膜片钳技术的可靠性和灵敏度。 二、膜片钳技术的改进与新进展 （一）穿孔膜片钳技术 1988年Horn等对传统全细胞记录进行了改进，建立了穿孔膜片钳技术。即利用某些抗生素具有在生物膜上形成通透性孔道的性质，将这类抗生素充灌在电极液中，在高阻封接形成之后自发形成全细胞记录模式。该技术中，抗生素形成孔道的有效半径为0.4—0.8 nm，可以选择性地通透Na+ 、K+ 、Li+ 、Cs+ 、Cl- 等一价离子，使细胞内环境相对稳定，电流的衰减现象减弱。并且抗生素对细胞的损伤作用小，高阻封接不易被破坏，记录的持续时间延长。 这种技术需要在避光条件下配制含有抗生素的穿孔液，配好后于4℃避光保存。充灌电极时， 先用不含抗生素的电极液充灌，然后再加入含有抗生素的电极液反向充灌电极。在这个过程中，应快速形成高阻封接，避免抗生素扩散到电极尖端抑制高阻封接的形成。 （二）在体膜片钳技术 在体全细胞记录膜片钳开始于研究感觉系统对外界刺激的反应特性和机理，因为这在离体标本上几乎是无法实现的。早期研究感觉系统的活体动物实验大多使用细胞外记录方法，这可以研究细胞对自然刺激如光，声音等的反应特性和规律，但不能涉及感觉信息处理的机制。这是因为细胞外单细胞记录只能得到一个细胞的最终输出，即动作电位，而不能获得其突触电位的波形，也忽略了所有的阈下反应。早期膜片钳记录的标本大多为急性分离的细胞，到20世纪80年代末，脑片全细胞膜片钳技术出现，20世纪90年代一些实验室在借鉴脑片膜片钳技术的基础上，尝试在整体动物( 一般是麻醉状态) 上进行膜片钳记录。最早的报道是Pei等在德国马普研究所的工作。他们通过对成年猫视皮层神经元进行全细胞记录，然后观察来自不同方向的光刺激所对应的突触后电流反应，以此探讨视觉信号传递和形成机制， 以及视皮层神经元功能和结构的关系。但可能是由于电极与细胞膜的封接不够好，记录到的细胞静息膜电位绝对值较小，动作电位的幅度也比正常值低很多。随后许多国家都开始了对在体膜片钳技术的研究。目前该技术越来越成熟，记录到的反应也越来越符合实际。 （三）全自动膜片钳技术 传统膜片钳技术每次只能记录一个细胞（或一对细胞），对实验人员来说是一项耗时耗力的工作，它不适在药物开发初期和中期进行大量化合物的筛选，也不适合需要记录大量细胞的基础实验研究，全自动膜片钳技术的出现在很大程度上解决了这些问题。全自动膜片钳技术是离子通道检测的新技术，它具有直接性、高信息量及高精确性的特点。与传统的膜片钳技术相比，它主要具有以下优点：效率高，是传统膜片钳效率的20—300倍；不需要专业电生理人员，简单易用，所有的操作可以在电脑软件控制的界面下完成，