猪血多肽的制备及其生物活性的研究.pdf

摘 要 我国每年屠宰生猪近5亿头，占世界生猪屠宰总量的45％，猪血资源十分丰 富，但目前除少量用于制作血豆腐、血肠或直接食用外，基本未得到开发利用， 不仅浪费了资源，同时又严重污染了环境。本课题以新鲜猪血为原料，利用自筛 的A32菌株进行发酵，获得低分子量的猪血多肽。同时研究了猪血多肽的抗氧 化、降血脂、增强免疫功能等生物活性，主要结果如下： 1．发酵猪血优良菌株的分离筛选 利用平板划线法，从农村个体屠宰场土壤中分离获得了菌株A32，该菌株在 以猪啦为惟一氮源的培养基上生长旺盛且蛋白酶活力强。利用该菌株发酵猪血 粉，使猪血粉的蛋白质含量下降了28．7％，氨基酸态氮含量上升了4．20倍，可溶 性蛋白质含量上升了60％，说明A32菌株是发酵猪血的优良菌株。 2．菌株鉴定 生理生化鉴定：革兰氏染色后为阳性，有芽孢，无伴孢晶体，该菌在细胞壁 染色后菌体内呈浅色，外围有明显的紫色圈，初步鉴定为产芽孢细菌。 rDNA序列提交GenBank进行Blast比对， 分子生物学鉴定：将A32菌株16s 经过同源序列比较，最终鉴定A32为枯草芽孢杆菌。 3．A32菌株产蛋白酶条件研究 通过单因素试验以及正交试验确定了A32优化培养基配方：豆粕粉2％、玉 米粉，％、0．4mmol／LM一+、Na2HP04·12H20 pH7．2；同时还研究了培养时间、摇瓶转速、接种量、温度对产酶的影响，试验 结果表明培养时间48h、接种量3％、温度30℃组合有利于蛋白酶的产生，摇瓶 转速190r／min较为理想。 4．A32菌株发酵猪血条件的优化 在探讨了发酵时间、温度、接种量、起始pH值，装料量等单因素对猪血发 酵影响的基础上，进行二次回归旋转组合设计，以接种量、发酵温度、发酵时间 三个因素为自变量，以水解度DH为响应值，应用响应面分析法研究了发酵nCf目J、 发酵温度、接种量对肽产量的影响。试验结果表明，发酵温度与时间及接种量对 猪血肽的生成有显著影响，发酵条件优化结果为接种量为4％、发酵温度为31℃、 发酵时间为60h，根据数学模型预测值为37．97％，试验实际值为37．956％。 5．猪血多肽的分离及其成分分析 发酵猪血通过微滤、超滤、喷雾干燥获得猪血多肽混合物，质谱分析结果表 明：猪血多肽中肽的分子量基本在2ku以下，并且在lku左右较为集中；氨基酸 分析结果：与猪血粉相比，猪血多肽游离氨基酸的组成发生了改变，其必需氨基 酸含量丰富，尤其大大改善了猪血粉中亮氨酸与异亮氨酸的不平衡，同时Glu(鲜 味)、Gly(甜味)等呈昧氨基酸含量显著提高，改善了猪血多肽的营养与风味； 组成氨基酸种类也发生了变化，猪血多肽胱氨酸和甲硫氨酸含量分别为6．198 mg／g和2．733mg／g，而猪血粉中未钡,tJH这两种氨基酸。同时，猪血多肽无论是 单个组成氨基酸还是氨基酸总量均远大于猪血粉。 6．猪血多肽安全性评价 急性毒理学实验：利用昆明种小鼠对猪血多肽进行了急性毒理学安全性评 价，试验结果显示猪血多肽对小鼠的LD。为9594mg／kg·bw，其95％置信区间为 l 1738—7841mg／kg·bw。 长期性毒理学实验：通过对SD大鼠长期灌胃，表明猪血多肽属实际无毒级。 7．猪血多肽抗氧化性研究 体外抗氧化试验：微弱化学发光分析法试验结果表明：猪血多肽对嘎、 m L一1 H202、·oH均有明显的清除作用，当其浓度分别为3．42、1．27、0．66g‘m 时，列‘嘎、H202、·OH的清除作用达到50％，说明猪血多肽具有一定的抗氧化 的活性。 体内抗氧化试验：以0．2ml溴代苯(o．3mol／L)致小鼠肝中毒，引起肝脂质 过氧化，给小鼠灌胃猪血多肽，检测小鼠肝脏和血清SOD、GSH-Px活性及MDA 含量，结果说明猪血多肽可以显著减轻活性氧对机体的损害，增强机体的抗氧化 能力。 8．猪血多肽增强免疫功能活性研究 免疫脏器质量测定：通过对小鼠腹腔注射环磷酰胺，造成免疫低下模型，猪 噬细胞吞噬鸡红细胞试验结果表明，猪血多肽能较好激活巨噬细胞的吞噬功能， 说明猪血多肽对正常小鼠非特异性免疫有调节作用。 肿胀率均有所提高，但只有高剂量组与对照组达到统计学显著性差异。说明猪血 多肽对正