PCR技术应用八DMSBMD基因诊断.pdfVIP

中国试剂网 3.9.46 PCR 技术应用八：DMS/BMD 基因诊断 DMD(Duchenne Muscular Dystrophy)和 BMD(Becker Muscular Dystrophy)是一种 常见的 X 连锁隐性遗传病，主要发生于男性，其发病率为 1/3500 活产男婴，其 发生的原因是 Dystrophin(抗肌萎缩蛋)其固缺陷所致. 一、DMD/BMD 的临床表现 在临床上 DMD 较 BMD 常见，发病早，症状重，正常于 2-3 岁即出现骨骼 肌无力的表现，一般从骨盒带肌肉无力开始而出现一系列的特殊症状:走路困难 呈鸭步，出现 Gowers 征，腓肠肌进行性肥大.逐渐出现心肌细胞受损，约 30% 的小儿智能力缺陷.在 12 岁左右失去能力，至 20 岁时正常死于呼吸衰竭和心力 衰竭.而 BMD 相对来说症状较轻，进展亦较慢. 二、DMD/BMD 的遗传病 (一)遗传方式:X-连锁隐性遗传，发病者多为男性，其母亲为致癌基因携带者， 尚有 1/3 的患者为散发病例，则新生突变引起. (二) ，DMD/BMD 的致病基因:1.基因定位:DMD/BMD 是因位于 Xq2 ，其基 因非常大约为 2400Kb.2.基因结构:该基因共有 79 个外显子，78 个内含子，其 CDNA 全长约为 13974 个时，编码的肽链含 3685aa 残基，编码蛋白命名为 dystrophine，其基本 5 个独立的启动子，在DMD 基因内还存在一些 STR，已知 有 13 个 STR，其中 5端编码区有 8 个，3端编码区有 个，44 ，45 ，49 ，30， 50 内含子各有一个STR，是多为DNDR 核心是(CA)n.等位基因数目为 2-19 个. 三、DMD 基因的突变类型 (一)缺失与重复:研究表明约 65%的 DMD/BMD 是由于基因内的部分缺失所 致，尚有 12.5%病例有基因内重复，这种突变变有两个高频发生区，一个在基因 的 5 端，另一个大致在第 45～55 外显子区域，而 5端的缺失重复热点大致在第 ～7 外显子区域.缺失的范围从 至数个外显子，甚至整个 DMD 基因亦可发生 缺失，启动子区亦有缺失发生. (二)单碱量换:近年来的研究还发现，在DMD 基因内尚有单碱其置换，目前 已发现的约有6 种，根认为在 DMD 患者中由此型突变引起者占 30%左右. (三)基因内连接形成和 mRNA 剪接异常:以上两种类型的突变亦在 DMD 人 群中有抗，但因研究的病印例尚少，需要进上步的研究. 中国试剂网 3.9.46 四、利用PCR 技术诊断 DMD 的途径 (一)用 PCR 技术检测缺失型突变. 利用 PCR 可直接检出 DMD/BMD 的缺失型突变，由于DMD/BMD 发生时， 其 65%的患者为基因缺失所致，因此直接检测缺失可使 65%的患者得到诊断.在 DMD/BMD 基因的缺失中，其缺失范围，缺失的位置具有高度异质性，加之 DMD/BMD 基因较大，很难用一对引物确定其缺失部位，随着 DMD/BMD 基因 的克隆及其精结构的阐明，有人开发了多时引物进行多重 PCR ，从而可使几乎 全部的缺失型 DMD/BMD 得到诊断. 1.利用 6 对引物扩增处于缺失热点区域的 6 个外显子，即外显子 8，16，19， 44 ，45 和 48 ，再加上外显子4 ，12，5 的 3 对引物，可检测 80%的缺失，若再 用 B