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从酵母细胞中分离纯化醇脱氢酶 柳畅先，吴士筠，胡卫钊 (中南民族大学化学与生命科学学院，武汉，430074) 摘要：本文报道了从酵母细胞中提取醇脱氢酶，并进一步纯化的过程。采用硫酸铵分级沉淀，SephadexG-100葡聚糖凝胶层析，DEAE-cellulose离子交换层析技术。收得率为2.5%，纯化倍数为26.2。 关键词 ：醇脱氢酶；分离纯化；酵母菌 中图分类号：Ｏ658 醇脱氢酶(ADH)除了在食品等工业中的作用之外，其在科学研究和分析测定中也具有重要价值，是酶法测定乙醇或乙醛含量的工具酶。沉淀法和层析法至今仍是广泛采用的分离蛋白质和酶的重要手段[1]。国内外在这方面的研究从20世纪70年代以来有很大进展，各种类型的层析技术用于生物大分子的分离，并得到迅速发展。用离子交换层析、亲和层析等方法分离纯化ADH和其它蛋白质[2～5]，经过4～5个纯化步骤后，纯化倍数可达100多倍。我国在酶的分离纯化技术上，酶制品的活性程度上，与国际先进水平相比还有较大的差距。所以对于酶分离纯化技术的研究，具有重要的意义。我们从酵母细胞中分离出醇脱氢酶，并通过硫酸铵分段盐析、凝胶层析以及离子交换层析对该酶进行纯化，用较少的步骤得到了相对高的纯化倍数。 １ 实验部分 1.1 仪器、试剂、菌种及培养基 HYA型恒温摇床；LRH-250-G型光照培养箱；GL-20B型高速冷冻离心机（中国科学院武汉科学仪器厂）；78-1型磁力加热搅拌器（杭州仪表电机厂）。 硫酸铵；Sephadex G-100（Promega公司）；DEAE-cellulose；牛血清白蛋白[BSA]（上海伯奥生物科技公司）；三羟甲基氨基甲烷[Tris]（北京化学试剂公司）；氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸[NAD]（武汉中健科技发展有限公司）。 酵母菌；牛肉膏蛋白胨液体培养基；琼脂斜面培养基。 1.2 实验方法 1.2.1 菌体培养 将酵母菌种接种于斜面培养基中，37℃培养24h后，再将菌种接种于液体培养基中，在恒温摇床37℃培养10h。离心收集菌体细胞，贮存于-20℃备用。 1.2.2 粗抽提液的制备 取以上菌体细胞，加入磷酸氢二钠溶液，37℃左右搅拌2h，再在室温下继续搅拌3h，3000r/min离心15min，保留上清液。 酶的纯化 将粗抽提液迅速加热到55℃，并不断搅拌，维持15min，然后迅速冷却至0℃，4000r/min 离心5min，保留上清液。 用饱和度分别为10%，20%，30%，40%，45%，50%，55%，60%，65%的硫酸铵分段盐析沉淀上清液，离心收集沉淀物，用Tris-HCl缓冲液溶解。 取45%～60%饱和度的盐析沉淀，溶于50mmol/L Tris-HCl(pH8.6)缓冲液中，上Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析柱，用相同缓冲液洗脱。 收集洗脱出的具有活性的酶液，上DEAE-cellulose离子交换层析柱，用浓度为0.1～0.4mol/L的NaCl梯形梯度溶液洗脱。 1.2.4 酶活力的测定 于石英比色皿中加入3mL0.05mol/L Tris-HCl缓冲液，40μL 0.05mol/L NAD溶液，40μL 17mol/L C2H5OH溶液后混匀，再加入一定量的酶液，快速混匀后立即在340nm处测定吸光度变化值，计算酶活力。以每分钟催化1μmol底物转化为产物的酶量定义为一个酶活力单位（U）。 1.2.5 蛋白质浓度的测定 采用Folin-酚试剂法[6]，以牛血清白蛋白作标准曲线。 结果与讨论 2.1 酵母细胞的生长以及细胞破碎 将斜面培养基上的菌种接种于液体培养基中，在36℃振摇培养。每隔一段时间取2mL培养液，在550nm波长处