PI-3K%2fGSK3β信号通路介导心肌营养素-1对心肌细胞缺氧复氧损伤作用.pdf

摘要 摘要 目的：通过研究体外培养的心肌细胞，利用心肌细胞急性缺氧复氧模型模拟心 胞成活率，心肌细胞凋亡，心肌肌酸激酶，线粒体模电位(a1l，m)等的影响，探讨 cT一1在心肌细胞缺氧复氧损伤中所起的作用及机制，通过CT一1信号通路 PI-3K／GSK3B阻断剂LY294002干预，从分子水平阐明PI一3K／GSK3B介导心肌营 养素一1对心肌细胞缺氧复氧损伤中的保护作用。 方法： 1．乳鼠心肌细胞培养：取出生1-3天的SD大鼠心肌组织，按改良的Simpson等 方法进行分次水浴搅拌消化，差速贴壁法纯化心肌细胞，以1×106／om2的细 胞密度接种于35mm培养皿。 2．缺氧复氧模型的建立：心肌细胞生长接近会合状态，呈现同步搏动时开始实 验。模拟缺血溶液配制缺氧液，以95％N：一5％C0：预饱和1h，将培养的细胞经缺 氧液缺氧3h，之后换成复氧液培养3h。 3．实验分组：(分5组) (1)对照组：更换培养基后CO：孵箱中正常培养；(2)缺氧复氧组：缺氧3h， 复氧3h处理； 氧3h处理；(4)缺氧复氧+CT-l+LY294002组(P13K／GSK3B阻断剂)：缺氧3h， 后加CT一1(10ng／m1)，进行复氧3h处理。 结果 1．心肌细胞搏动频率与节律：各组基线心肌细胞搏动频率均为148次／分左右， 各组无明显差异，节律规整。缺氧复氧后心肌细胞搏动频率教复氧前明显减 缓，搏动幅度减弱，节律不规整。CT-I处理组搏动频率与缺氧复氧前比较无 明显减慢，与对照组相近，节律整齐。而阻断剂LY294002干预后，频率明显减 Il 摘要 慢，搏动幅度减弱，节律明显不规则，而助溶剂DMSO并不干扰CT一1的作用。 表明LY294002特异性阻断了C1’一1对缺氧复氧损伤的心肌细胞的保护作用。 2。心霆蘧细胞的损伤：对照组心肌细胞存活率为96．2--+3．2％，凋亡率为2．8-+ O．4％。缺氧复氧损伤后心肌细胞存活率明显降低，为76．8±4．6％，心肌细胞 和凋亡的增加，存活率较缺氧复氧组明显升高(89．8±8．3％VS78+8± 率较CT-1组下降，而心肌细胞凋亡率增加。 3 心肌细胞线粒体膜电位△鼙m：缺氧复氧组明显小于对照组(86．28± 50．13±5．82VS69．1 1±6．62VS69．1 3±6．84，54．5 3±6．84，P均O．05)，两阻断剂 组无明显差异，瑟DMSO组与CI-I组类似。 4．心肌细胞P13K蛋囱和磷酸化P13K蛋白水平：各组P13K蛋白表达无明显差 VS 异，但磷酸化P13K蛋白水平缺氧复氧组较空白对照组增加(0．474±0．032 径使磷酸化P13K蛋白水平表达舞高。 5。心肌细胞GSK38蛋自表达和磷酸化状态：各组经3小时缺氧，3小时复氧压， 心肌细胞GSK3B蛋白表达差异无统计学意义。但缺氧复氧组较空白对照组 磷酸化GSK3B蛋白表达明显减少，而CT一1组较缺氧复氧组显著上升，加 P13K／GSK3 B阻断剂后磷酸化GSK3§蛋白表达明显减少，而劲溶剂组与CT-1 组无明显差异，表明CT-1有促进缺氧复氧心肌细胞磷酸化的作 用，P13K／GSK3B阻断剂可以抑制CT-1的这种作用。 6．心舰细胞Caspases3蛋白表达：各组蛋自上样量无明显差异，经缺氧复氧后， B阻 ⅡI 摘要 0．034，PO．05)。 胞凋亡的作用，P13K／GSK313阻断剂可以抑制CT一1的这种作用。 结论： 1． aT-1能减轻缺氧复氧引起的心肌细胞损伤，表现在：改善心肌细胞搏动 频率与节律，提高心肌细胞存活率和降低凋亡率，