斑点杂交实验.doc

斑点杂交实验 探针的标记： 取DNA 2ug于20ul 水中，于沸水中煮沸变性10分钟，迅速放入冰中，5分钟。加入4ul prime混合物，37°C过夜，加0.5M EDTA 1ul终止反应，保存于－20°C冰箱中备用。 点膜： 样品DNA：50ng/dot 2ul/dot 阴性对照鱼精DNA：50ng/dot 2ul/dot（浓度5mg/ml 1:200稀释） 变性：1N NaOH 30分钟 中和：0.6M NaCl、1M Tris－HCl pH7.2 15分钟x1 3M NaCl\ 0.5MTris-HCl 15分钟x1 漂洗：2XSSC 迅速漂洗一次。将膜夹滤纸中，120°C烤30分钟。用保鲜膜包好，于4°C冰箱备用。 预杂交： 预杂交液 去离子甲酰胺 10ml 20xSSC 5ml 0.4M PB 1ml 50x denhardt’s 5ml 鱼精DNA（变性） 0.4ml（5mg/ml） 膜于杂交管中，加入预杂交液，于杂交仪中42°C 3－5小时。 杂交： 杂交液的配制： 标记好的探针DNA、鱼精DNA于100°C沸水中变性，置冰中10分钟待用。 去离子甲酰胺 10ml 20xSSC 5ml 0.4M PB 1ml 50x denhardt’s 0.4ml 鱼精DNA（变性） 0.4ml（5mg/ml） 双蒸水补 4ml 探针DNA（变性） 20ul 于42°C杂交过夜。 漂洗： 62°C 2×SSC--0.1% SDS 15’ 0.1×SSC--0.1%SDS 15’ 0.1×SSC 15’ (以下步骤于0.05M Tris.HCl－0.12M NaCl系统中,均在室温) 封闭：封闭液1ml （5% 脱脂奶粉 ） 0.5－1小时 漂洗：用0.05M Tris.HCl－0.12M NaCl 1ml 漂洗 1×10’ 抗体：1ml 1-2小时 （1：3000-1:10000） 漂洗：用0.05M Tris.HCl－0.12M NaCl 漂洗 3(1ml)×10’ 显色：药片一片，30ml蒸馏水中，显色3－5分钟。用水终止反应