组织细胞RNA快速提取.pdfVIP

中国试剂网 3.15.3.14 组织细胞RNA 快速提取 操作步骤：（实验前请先阅读注意事项） 提示： 第一次使用前请先在漂洗液RW 瓶和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇! 操作前在裂解液RLT 中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1 ml RLT 中加入10μl β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的RLT 4 ℃可放置一个月。 1. 组织培养细胞 a. 收集107 悬浮细胞到一个1.5ml 离心管，对于贴壁细胞，孔板培养可以直接裂 解，细胞瓶培养应该先用胰蛋白酶消化后吹打下来收集。 b. 13 ，000rpm 离心10 秒（或者300g 离心5 分钟），使细胞沉淀下来。完全吸弃 上清，留下细胞团，注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量纯度降低。 c. 轻弹管壁将细胞沉淀完全松散重悬，加入 350μl （5x106 细胞）或者 600μl （5x106-1x107 细胞）裂解液RLT ，吹打混匀后用手剧烈振荡20 秒，充分裂解。 d. 用带钝针头的一次性 1 ml(配0.9mm 针头) 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到 得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30 秒),可以剪切DNA, 降低粘稠度和提高产量。 e. 接操作步骤项下3 。 2. 动物组织（例如鼠肝脑） a. 电动匀浆：新鲜组织用解剖刀迅速切成小碎块,加入 350μl(20mg 组织)或者 600μl(20-30mg 组织) 的裂解液RLT 后电动彻底匀浆20-40 秒。 b. 液氮研磨+匀浆：在液氮中研磨组织成细粉后，取适量组织细粉(20mg/30mg) 转入装有350μl/600μl 组织裂解液RLT 的1.5ml 离心管中, 用手剧烈振荡20 秒， 充分裂解。用带钝针头的一次性 1 ml(配0.9mm 针头) 注射器抽打裂解物 10 次 或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆 30 秒),可以剪切 DNA, 降低粘稠度和提 高产量。 c. 将匀浆后裂解物 13，000rpm 离心3 分钟,沉淀可能存在的裂解困难的碎片或者 不溶物, 将裂解物上清小心转到一个新离心管。 d. 接操作步骤项下3 。 3. 较精确估计裂解物(上清)体积,加入等体积的70%乙醇（请先检查是否已加入无 水乙醇!）,此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。 中国试剂网 3.15.3.14 4. 立刻将混合物(每次小于700μl,多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA 中，（吸 附柱放入收集管中）13,000 rpm 离心60 秒，弃掉废液。 5. 加700μl 去蛋白液RW1 ，室温放置30 秒，12，000rpm 离心30 秒，弃掉废液。 如果DNA 残留明显,可在加入RW1 后室温放置5 分钟再离心。 6. 加入500μl 漂洗液RW （请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心30 秒，弃掉废液。加入500μl 漂洗液RW,重复一遍。 7. 将吸附柱RA 放回空收集管中，13,000 rpm 离心2 分钟，尽量除去漂洗液, 以 免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。 8. 取出吸附柱RA ，放入一个RNase free 离心管中，根据预期RNA 产量在吸附 膜的中间部位加30-50μl RNase free water （事先在 70-90 ℃水浴中加热可提高产 量）， 室温放置1 分钟，12,000 rpm 离心1 分钟。 9. 如果预期RNA 产量30μg,加30-50μl RNase free water 重复步骤8, 合并两次洗 脱液,或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要 RNA 浓度 高) 。 洗脱两遍的 RNA 洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的 RNA