限制性内切酶质量控制.pdfVIP

中国试剂网 3.9.239 限制性内切酶质量控制 单位定义 限制性内切酶的一个活性单位是指，在 50l 的反应体系里，采用随酶提供的 NEBuffer ，用 1 个小时的时间，彻底消化 1g 底物DNA 所需要的酶量。 酶切 反应应在带盖的Eppendorf 管中进行，选用技术数据卡上所标明的适宜温度。在 确定酶活性之前，浓缩的酶应该用推荐的贮存液稀释成大约1,000 单位/ml 。 质量控制 所有质量控制鉴定结果都公布在随酶提供的技术数据卡上。 非特异性内切酶鉴定 为鉴定非特异性内切酶污染，限制性内切酶与缺少该酶识别序列的超螺旋 DNA 底物温育。对于RF I 型DNA(超螺旋形式 ，一个单一的非特异性缺口就会将它 转变成RF II 型DNA(带缺口环状 。小份的限制性内切酶与1gDNA 在50l 反 应体系中，采用推荐的NEBuffer ，在推荐的温度下温育4 小时。两种形式的DNA 在琼脂糖凝胶上很容易区分，可以计算出从RFI 到 RFII 的转化率。 核酸酶污染的过夜鉴定 所有的限制性内切酶与1g 底物DNA 在50l 反应体系中，采用推荐的NEBuffer 温育过夜。比较酶切1 小时的特征带型和过夜酶切的带型。如果两种情况下带型 均明显、没有改变，则说明测试的酶中不存在非特异性的DNA 酶。我们报道了 可以温育过夜的最大酶单位数。 核酸外切酶污染鉴定 所有的限制性内切酶与 1g 单双链混合的、3H 标记的 E.coli DNA (200,000 cpm/g 在50l 反应体系中，采用随酶提供的NEBuffer ，在推荐的温度下温育4 小时。通过可溶解的TCA 着色，可以计算出反应体系中被标记的DAN 的百分 比，进而可以显示出核酸外切酶的污染。该种方法可检测出的底线是0.05% 。 DNA 片段的连接 DNA 片段通过用每一种限制性内切酶过量消化底物DNA 而获得。这些片段随后 用T4DNA 连接酶连接(5′ 末端浓度为0.11.0M 。连接的片段然后用同一种限 制性内切酶重切。仅当3′ 和 5′末端都保留完整，连接反应才会发生；而且只有 那些识别位点完全恢复的分子才能被重切。切割后正常的带型说明3′ 和 5′末端 中国试剂网 3.9.239 都是完整的，而且准备的酶样品中检测不到核酸外切酶和磷酸酶。 蓝白斑筛选鉴定 用于克隆的酶还须通过额外的质量鉴定――蓝白斑筛选鉴定，以确定经酶过量消 化后 DNA 末端的完整性。该种鉴定方法为：用酶 10 倍过量消化适当的载体上 lacZ 基因中单一的酶切位点，连接，转化，并涂XGal/IPTG/Amp 平板。成功地 切割、连接和表达bgalactosidase 可以说明克隆后基因是完整的，一个完整的基 因产生蓝斑，一个不完整的基因(例如，降解的DNA 末端产生白斑。在进行蓝 白斑鉴定中，所有的限制性内切酶产生的白斑数量不应超过3 ％。