定量PCR数据处理.pdf

定量PCR：数据处理 报告人：丁达 021 dingda@ 材料来源：陈云地博士 （美国应用生物系统公司技术专家） 内容提要 定量PCR的实验要素 定量PCR的实验目的 定量PCR的数据处理 2 定量PCR的实验要素 定量PCR实验要素 目标基因 未知样品 产生标准曲线 标准品 监控试剂、系统 阳性对照 监控污染 阴性对照 数据之间可比性 内对照(IPC) 校正操作误差 参比荧光(ROX) 降低定量误差 3-6复管 4 96-孔板设置举例 阳性对照 标准品 阴性对照 未知检材 5 DNA样品 模板可以是DNA、cDNA或者质粒 RNA需要先反转录成cDNA；反应只能以cDNA为模板， 但是可以通过标准曲线或者相对定量直接定出RNA的数 量或者比例 DNA纯度：OD260/OD280=1.8，可以在1.6 ~ 2.0之间 =1.8: 纯DNA 2.0: RNA污染 1.6: 蛋白质/酚污染 DNA用量：基因组DNA：0.1 ng – 1 ug，最好10-100 ng/rxn 来源：血样、组织等 自己制备（血样：如蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提，酒精 /NaAc纯化） 6 RNA样品 RNA用量：60 ng – 2 ug / RT-rxn； RNA纯度：OD260/OD280=2.0 来源：血样、组织、病毒等 反转录：100 uL的反应体系可以将最多2 ug 总RNA反 转录成cDNA；如果总RNA2 ug，分开做复管 cDNA用量：1-100 ng RNA反转录所得cDNA加 1 uL/rxn 7 标准品的要求 log X O log(RT −RB ) −log RS C − + T log(1+EX ) log(1+EX ) 标准品用来生成标准曲线，建立CT值与浓度之间的数学关系 不要求： 数学关系是抽象的、普适的，不要求标准品与目标基因一定具有相 同的生物学意义 所以，同一个片段可以使用，不是同一个片段也可以使用 任何DNA片段，PCR产物、质粒、病毒的PCR片段等均可 要求： 浓度已知 PCR效率尽量接近，越一致误差越小 同样条件下完成：同样的仪器、试剂、循环参数、同一次实验 同样质量的模板、同样Tm值的引物和探针 8 PCR效率对定量结果的影响 n = 30 30