实验一染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列.ppt

* 现代微生物学实验技术 谢响明 北京林业大学生物科学与技术学院 办公地点：生物楼117；电话 实 验 内 容 ? 染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列 ? 转座子随机突变及目的表型的筛选 ? 大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导 ? 利用SDS分析融合蛋白的可溶性 ? 绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取 染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列 —TAIL-PCR 实验目的 1. 掌握TAIL-PCR的原理，增强对PCR重要性的认识； 2. 掌握TAIL-PCR的实验流程，为将来课题研究奠定 基础。 TAIL--PCR 的原理 特异引物序列： Sp1:CGAGCAGATGGTTCTTGG Sp2:TGGCGAGTGAGACGACGAGT Sp3:TGGAGAACTT GTAACCCTTG GTG a hot arbitrary degenerate primers: AD1：5′-TG(A/T)GNAG(A/T)ANC(G/C)AGA-3′； AD2：5′-AG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(A/T)AGG-3′； AD3：5′-CA(A/T)CGICNGAIA(G/C)GAA-3′； AD4：5′-TC(G/C)TICGNACIT(A/T)GGA-3′。 TAIL--PCR 的原理 TAIL‐PCR:Thermal asymmetric?interlaced?PCR Liu?et?al.,?1994 操 作 步 骤 第一轮TAIL-PCR： 反应体系 成分 水 2×GC Buffer dNTPs 嵌套引物（Sp1） 简并引物（AD1、AD2、AD3、 AD4） 基因组DNA Taq酶 贮液浓度 —— Mg2+ Plus 2.5mmol 10pmol/μl 10pmol/μl 100μg/ml 5U/μl 使用量(50μl体系) 12μl 25μl 8μl 1.5μl 2μl 1μl 0.5μl 操 作 步 骤 反应条件： 反应 第一轮 循环次数 1 5 1 10 15 1 反应条件 95℃（2min） 94℃(30s);600℃ (1min);72℃ (2min30s) 94℃ (30s);25℃ (1min);72℃ (2min30s) 94℃ (30s);44℃ (1min);72℃ (2min30s) 94℃ (15s)；60℃ (1min)；72℃ (2min30s) 94℃ (15s)；60℃ (1min)；72℃ (2min30s) 94℃ (15s)44℃ (1min)；72℃ (2min30s) 72℃ (10min) 操 作 步 骤 反应 第二轮 第三轮 循环次数 15 1 15 1 反应条件 94℃ (30s); 58℃ (1min); 72℃ (2min30s) 94℃ (30s); 58℃ (1min); 72℃ (2min30s) 94℃ (30s); 44℃ (1min); 72℃ (2min30s) 72℃ (10min) 94℃ (30s); 58℃ (1min); 72℃ (2min30s) 94℃ (30s); 58℃ (1min); 72℃ (2min30s) 94℃ (30s); 44℃ (1min); 72℃ (2min30s) 72℃ (10min) 操 作 步 骤 1%的琼脂糖凝胶电泳分析 *