棉花胞质雄性不育系与保持系线粒体基因组差异研究.pdf

摘要 棉花细胞质雄性不育(CMS)是母性遗传性状，在杂交棉制种中有重要的应用价值。通过不 育系、保持系和恢复系的“三系”配套，以及“三系法”制种，可实现杂交棉种子规模化生产。 目前，国内外已育成哈克尼西棉、三裂棉、陆地棉、海岛棉等胞质的不育系，并实现三系配套， 细胞质雄性不育的基因被认为是位于线粒体基因组上，但是关于棉花CMS相关基因的研究报道 Southern blot分析，克隆了不育胞质和可育胞质之间的差异序列，获得了胞质特异的RFLP、SCAR、 SSR分子标记，并对差异序列进行了表达分析，为进一步克隆不育基因奠定了基础。 本研究通过同源克隆的方法，获得了棉花31个线粒体基因的保守序列，从中选取20个基因 blot 段均不相同。 限制片段。在可育胞质中，EcoRI限制片段长度分别是2225 bp和5083bp，Hindlll限制片段的长 1689 度分别是l bp和8501bp；不育胞质中，EcoRI限制片段长度分别是2194bp和3297bp，倒hdⅢ 1658 限制片段的长度分别是1 bp和9139bp。序列分析发现，棉花atpA基因在可育胞质和不育胞 质中各有两个拷贝：一个完整拷贝和一个3’截短型拷贝。完整atpA基因全长1524bp：而可育 胞质和不育胞质中的截短型atpA编码序列分别在1352bp和1336bp处截断。 在完整atpA拷贝RFLP片段的3’端，即atpA基因下游第161．212bp处，可育胞质(P30B) 短型拷贝RFLP片段上，即atpA编码序列截断位点(“断点”)后，可育胞质和不育胞质中分别存 在一段515 bp(“N515”)和555bp(“$555”)的差异序列，这两条差异序列完全不同，我们将其 开发成SCAR515和SCAR555标记。这三个标记可用于鉴定棉花可育胞质和不育胞质。 隆到了CMS．D8的差异EcoRI限制片段(4540 bp)，发现其中的序列与P30A相比存在5处SNP CMS系进行区分。 bp)中存在6处RNA编辑位点，且不育胞质与可育胞质的RNA编辑率基本相同；在截短型拷 贝中存在4处RNA编辑位点，不育胞质的RNA编辑率明显高于可育胞质，说明不育胞质截短 隆到不育胞质砷m全长拷贝和截短型拷贝的转录本全长，发现atpA全长拷贝转录本中包含完整 SSRl60位点；atpA截短型拷贝转录本中包含完整“$555”序列。 在atpa基因3’侧翼区，存在一些短重复序列，这些序列来自于had6基因3’部分编码序 列。在不育胞质中，这些短重复序列位于关键的“断点”位置，推测其在不育胞质线粒体基因组 重排中发挥重要的介导作用。根据短重复序列在两种胞质中的位置和拷贝数不同开发出一个 blot分析显示，nad6基 SCAR标记：SCARN6，可用于鉴别棉花可育胞质和不育胞质。Northern 因在棉花“三系”及Fl代中都只有一个转录本(850 bp)，且丰度基本～致。利用cRT-PCR法克 隆到had6基因的转录本全长，发现其mRNA在基因组终止密码子之前一14和-15bp处提前终止， 即该基因无终止密码子。 推测rrnl8基因与棉花CMS可能相关。 本研究首次克隆到了棉花细胞质雄性不育胞质和可育胞质线粒体基因组中atpA基因的所有 复序列，并在CMS系线粒体基因组重排中发挥重要介导作用；发现不育胞质比可育胞质缺失一 个rrnl8基因拷贝；获得不育胞质中atpA全长拷贝和截短型拷贝以及had6基因的转录本全长， 并发现截短型atpA基因的编辑率在两种胞质间存在明显差异。这些结果为进一步克隆棉花细胞 质雄性不育基因奠定了基础。 关键词：棉花，细胞质雄性不育，线粒体基因组，atpA，RFLP，SCAR，SSR Abstract male a inh