改进重叠延伸PCR技术构建定点双突变.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，３０（１０）：４９５４ 改进重叠延伸ＰＣＲ技术构建定点双突变 １ ３ ３ ２ ２ ３ 徐书景 　张跃灵 　张　妍 　赵宝华 　鞠建松 　马延和 （１河北师范大学旅游学院食品系　石家庄　０５００１６　２河北师范大学生命科学学院　石家庄　０５００１６） （３中国科学院微生物研究所　北京　１００１０１） 摘要　目的：目的ＤＮＡ片段中快速构建位点不同的定点双突变体。方法：借鉴ＤＮＡｓｈｕｆｆｌｉｎｇ技 术中ＤＮＡ小片段延伸扩增获得全长ＤＮＡ片段的工作原理，与常规基因定点突变技术相结合，改 进重叠延伸ＰＣＲ技术构建定点双突变。结果：对嗜酸热脂肪杆菌（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ） Ｔｃ１２３１的甘露聚糖酶基因ＡａｍａｎＡ中两个可能的活性位点Ｅ１５１和Ｅ２３１进行双点突变，先后经 过无引物和有引物两步ＰＣＲ，扩增获得全长ＤＮＡ，测序结果表明得到预期的定点双突变体；酶活 性检测和薄层层析结果表明双点突变体丧失了酶的活性。结论：改良的重叠ＰＣＲ技术，能经济、 简便、高效地获得双点定点突变体，在酶的催化机理的阐述、蛋白质结构改造等分子生物学领域 中具有较高的应用价值。 关键词　重叠延伸ＰＣＲ　定点双突变　甘露聚糖酶 中图分类号　Ｑ８１９ 　　在基因功能研究中，常需要通过定点突变对基因 基因。此方法同样可适用于构建多点突变的ＤＮＡ片 中某一个或两个甚至多个氨基酸残基进行突变，以研 段，具有一定的推广价值。 ［１］ 究其功能和结构的改变 。对于向ＤＮＡ片段中导入 １　材料与方法 单一位点的突变，目前常用的方法是通过设计 ＰＣＲ引 物引入所需要的突变，技术很成熟，也有现成的试剂盒 １．１　试剂、载体和菌种 可以选择，如 Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ公司的 ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＳｉｔｅ 　　ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＤＮＡ ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ，伯乐公司的ＭｕｔａＧｅｎｅｉｎｖｉｔｒｏ ｍａｒｋｅｒ购自天根公司；ｐｆｕＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ和Ｔ４ＤＮＡ ［２］ ｌｉｇａｓｅ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司，Ｎｈｅ 和Ｈｉｎｄ 等限制内切 ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ等 ，但是这些试剂盒价格昂贵，且它 Ⅰ Ⅲ 们并不能保证１００％的突变率，因此往往不能作为我们 酶购自ＴａＫａＲａ公司；ＤＮＡ琼脂糖凝胶回收试剂盒购自 的首选方法。而基于ＰＣＲ的定点突变技术由于其突变 Ｏｍｅｇｅ公司；质粒ｐＥＴＭａｎＡ由中科院微生物研究所张 ［６］ 效率高、操作简单、耗时短、成本低廉等优点而倍受瞩 跃灵博士构建并提供 ，所含待突变的甘露聚糖酶基 目，如重叠延伸 ＰＣＲ技术 （ｇｅｎｅｓｐｌｉｃｉｎｇｂｙｏｖｅｒｌａｐ 因ＡａｍａｎＡ克隆于嗜酸热脂肪杆菌（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ［３４］ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）Ｔｃ１２３１，该基因长９６３ｂｐ，［Ｇ＋Ｃ］％为 ｅｘｔｅｎｓｉｏｎＰＣＲ，简称ＳＯＥＰＣＲ） ，这种技术运用非常 广泛、灵活，不仅能实现基因定点突变，还能便利地实 ６５．２％，编码 ３２１个氨基酸，ＧｅｎＢａｎｋ登 录号为 ［５］ ＤＱ８３８０４５；用于基因克隆和表达的大肠杆菌 ＤＨ１２Ｓ、 现大片段的插入及删除 。但该技术对于同一 ＤＮＡ 片段中两个及以上不同位点进行突变，则需采用多轮 ＢＬ２１（