一步PCR法在单碱基定点诱变中的应用(论文资料).pdfVIP

第 13卷 1期 天 津 医 科 大 学 学 报 Vo1．13．No．1 98 2007年 3月 JOURNALOFTIANJINMEDICALUNIVERSITY Mar．2o07 一 步PCR法在单碱基定点诱变中的应用 刘玉冰，李晓霞，王宝利，张镜宇 (天津医科大学内分泌研究所二室，天津 300070) [关键词]聚合酶链反应；定点诱变；重叠延伸PCR [中图分类号]Q7 [文献标识码]B [文章编号]1006—8147(2007)01-0098—02 定点诱变技术广泛应用于基因工程和蛋白质工 游引物各0．4Ixmol／L。PCR扩增条件为：95℃预变性 程，常用的方法有化学诱变、寡核苷酸介导的诱变 ， 3min；94oC变性 40S，60oC退火 30S，72oC延伸 1 盒式诱变和基于PCR的诱变，其中基于PCR的诱 min，30个循环；最终于72℃延伸5min结束反应[1]。 变包括重叠延伸PCR (over—lapextensionPCR，OE— 1．2．3 抽提 PCR产物 PCR产物补充双蒸水至总 PCR)，大引物 PCR (megaprimerPCR)，环状质粒 体积200Ixl，加入20 l3mol／L醋酸钠，加等体积酚： PCR。本方法属于环状质粒PCR，与常用的OE—PCR 氯仿：异戊醇(25：24：1)，振荡混匀，4℃离心机 1．32x 相比，本方法在质粒上进行诱变更为简便快捷，只需 104r／min离心 2min。移上清至另一个 1．5rIllEp． 设计一对引物，进行一次PCR。 pendorf离心管．加 2．5倍体积 95％冰预冷乙醇．振 1 材料和方法 荡混匀，4℃离心机 1．32x104r／rain离心20rain沉淀 1．1 材料 T4激酶，T4DNA连接酶、PfuDNA聚合 核酸。弃去上清，加 1ml70％冰预冷乙醇振荡漂洗 酶，限制性内切酶Eaml105I，EcoRI，dNTP均购 沉淀两次。37℃温箱蒸发乙醇，加 10 l双蒸水溶解 自于Ferment公司；JM109菌种．质粒pUC18由本实 DNA．温和振荡5min。 验室保存；引物由上海生工生物工程公司合成；DNA 1．2．4 自环化质粒 采用20 l5羟基端磷酸化体 MarkerDL2000购 自大连TaKaRaBiotech公司：一般 系：含T4激酶 1 l，10×T4激酶buffer2Ixl，10mmol／L 试剂为进 口或国产分析纯级产品。 ATP2Ixl，抽提的PCR产物片段 8 l。37℃1h，70℃ 1．2 方法 10min灭活T4激酶。10 l连接体系：含 T4DNA连 1．2．1 选择诱变位点 选择质粒pUC18的第 1695 接酶1Ixl，lOxT4连接酶buffer1 l，上述5羟基端磷 个碱基作为诱变位点，该碱基存在于编码氨苄青霉 酸化的线性质粒5 l，20℃3h。实验流程示意图 素抗性区域的限制性内切酶Eaml105I的识别位点 见图 1 上．即方框中的碱基：5-G~NNN*NNGTC一3(1 694—1704)，根据简并性原则设计引物 P1，将该位置 的碱基A替换为G。P1的碱基序列为5-~TCCC． cGTcGTGTAGATAAc一3(其余为与质粒互补序 列)，替换后氨苄青霉素抗性区域的读码框架未变， _ ^CC1．ATCAACCCACTCACCCCCA————