HPLC测定奶粉中三聚氰胺.docVIP

HPLC测定奶粉中三聚氰胺 1 原理三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，微溶于水，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。本方法采用20%甲醇溶解样品，5%三氯乙酸沉淀蛋白，提取样品中的三聚氰胺，经液相色谱仪C18柱分离，检测波长235nm条件下进行检测。 2 试剂 使用优级纯、色谱纯试剂，色谱用水符合GB/T6682一级水的规定。2.1? 20%甲醇溶液：甲醇+水(2+8)? 2.2? 5%三氯乙酸溶液：称取三氯乙酸5g溶解于100mL水中。2.3? 乙腈 2.4? 混合液：称取2.10g一水合柠檬酸和1.88 g己烷磺酸钠，溶于水中，稀释至1000mL混匀。2.5? 流动相：混合液（2.4）+乙腈（2.3）=92+8。2.6? 标准储备液配制：准确称取三聚氰胺标准品0.1000g，用20%甲醇溶液（2.1）定容至100mL。三聚氰胺含量为1.00mg/ mL，于4℃冰箱内避光保存。2.7三聚氰胺标准系列的配制：准确吸取标准储备液(2.6)0.100mL；1.00mL；2.50mL；5.00mL； 10.00mL至100mL容量瓶中，并用20%甲醇溶液（2.1）定容至刻度。配制成三聚氰胺浓度分别为1.00mg/L；10.0mg/L；25.0mg/L；50.0mg/L；100mg/L的标准系列。 3仪器和设备3.1 液相色谱仪：附二级管阵列检测器（DAD）或紫外检测器（UV）3.2 超声波清洗器3.3 超速离心机3.4 涡旋混合器3.5 滤膜：0.45μm 4 分析步骤4.1 试样处理：将奶粉样品混匀，准确称取样品1～5g于50mL比色管中，加入20%甲醇溶液（2.1）约35mL，震荡混匀，超声提取5min，加入5%三氯乙酸(2.2)5mL，并用20%甲醇溶液(2.1)定容至刻度，摇匀。以3000rpm/min超速离心5min。取上清液经0.45μm滤膜过滤，备用。4.2 色谱参考条件4.2.1 流动相：10mmol/L己烷磺酸钠+10mmol/L柠檬酸∶乙腈=92∶8；4.2.2 流速:1.0ml/min；4.2.3 柱温：35℃；4.2.4 检测器：二极管阵列检测器（DAD）或紫外检测器（UV），波长235nm；4.2.5 色谱柱：C18柱子250mm ×4.6 mm，5μm；4.2.6 进样量：10～20μL4.3 色谱分析：进样10～20μL标准使用液及样品处理液于高效液相色谱仪中，以保留时间及光谱定性，以样品峰面积与标准系列比较定量。 5 结果计算样品中三聚氰胺含量按下列公式进行计算。??? X=C×V×1000/(m×1000)式中：X—样品中三聚氰胺的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；C—从曲线上查出样品中三聚氰胺浓度，单位为毫克每升（mg/L）；V—样品中总体积，单位为毫升（mL）；m—样品质量，单位为克（g）。 6 色谱图图1三聚氰胺标准高效色谱图（1—三聚氰胺）  图2 三聚氰胺标准品紫外吸收光谱图 图3 奶粉样品三聚氰胺液相色谱图（1-三聚氰胺） 图4 奶粉样品中三聚氰胺的紫外吸收光谱图 7精密度在重复性条件下获得的两个独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。?? 8 其它8.1 标准曲线及线性范围在上述实验条件下，分别取三聚氰胺标准使用液0.911、9.11、22.8、45.6、91.1mg/L，以峰面积对比浓度绘制标准曲线，结果如下：线性方程及相关系数： A=81.7c+56.3? r=0.9999????????????????式中：A—峰面积；c—浓度，单位为毫克每升（mg/L）8.2 方法最低检出限参考取样量，定容量和仪器进样量等因素，提出本方法的最低检出限为5 mg/kg。8.3 精密度实验（n=7）按此方法测定奶粉中三聚氰胺含量，平行测定7份，数据见表1。表1 奶粉中三聚氰胺测定的精密度实验结果? 测定次数?含量(mg/kg)??? 1???????? 45.8??? 2???????? 46.8??? 3???????? 46.7??? 4???????? 46.2??? 5???????? 46.2??? 6???????? 45.9??? 7???????? 46.0??平均值????? 46.2??RSD（%）???? 0.9 8.4 回收实验?? 采用添加回收实验来考查方法准确度，测定奶粉中三聚氰胺加标回收实验结果见表2。表2 奶粉中三聚氰胺加标回收实验结果样品名称?本底值mg/kg?加标量mg/kg? 测量值mg/kg?回收率(%)?平均回收率（%）??奶粉1???? 616???????? 89.2???????? 702??????