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Expression and purification of ancrod, an anticoagulant 主要内容 Abstract 1 Materials and methods 1.1 Materials 1.2 Construction of ancrod expression plasmid 1.3 Construction and selection of ancrod expression strain 1.4 Expression of recombinant ancrod 1.5 Purification of recombinant ancrod 1.5.1 SDSof recombinant ancrod and deglycosylated recombinant ancrod assay 1.5.2 fibrinogenolytic assay 1.5.3 fibrinogen clotting assay 1.5.4 zymographic assay 2 Results and discussion 2.1 Construction of ancrod express ion plasmid 2.2 Expression of recombinant ancrod 2.3 Purification of recombinant ancrod 2.4 Transformation and selection for positive clones 2.5 Pichia expression of ancrod 2.6 Biological characterization of ancrod 3 Conclusion Abstract 1.目的：利用毕赤酵母表达具有生物学活性的蛇毒类凝血酶。 2.方法：根据已知的天然蛇毒类凝血酶的氨基酸序 列 , 结合酵母偏好密码子 , 设计并合成了蛇毒类凝 血酶 基因序列,将其克隆至表达载体pPIC 9中,得到 表达质粒pPIC9 /Ancrod,电转至毕赤酵母GS115(His-)菌株感受态中,通过表达筛选获得工程菌株 。 3.结论：采用毕赤酵母表达系统表达并获得有生物学 活性的重组蛇毒类凝血酶 , 为大规模生产打下了基 础 。 1.Materials and methods 1.1 Materials 大肠杆菌DH5α、毕赤酵母 GS115 和表达质 粒 pPIC9 由本实验室保存 ; pGEM-5zf-Ancrod 由军事医学科学院生物工程研究所研 究人员构建 ; 其他试剂有生物公司提供。 1.Materials and methods 1.2 Construction of ancrod expression plasmid 1.设计蛇毒类凝血酶基因序列 (GenBank Accession No.EF210486) ,采用PCR方法合成 , 将其克隆至质粒 pGEM -5zf中,经测序证明完全正确。 2.利用限制性内切酶 XhoⅠ和EcoRⅠ分别双酶切 pGEM -5zf-Ancrod、pPIC9、连接载体与目的片段 , 连 接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态中 , 涂布 LB /Amp+平 板 , 待长出单菌落后进行菌落PCR鉴定。 3.提取阳性克隆的质粒 pPIC9-Ancrod, 用 XhoⅠ /EcoRⅠ 双酶切 , 1% 琼脂糖凝胶电泳酶切产物 。 1.Materials and methods 1.3 Construction and selection of ancrod expression strain 用限制性内切酶BglⅡ酶切pPIC 9-Ancrod, 回收含蛇毒类凝血酶基因的DNA片段 (6300 bp) , 将其电转至毕赤酵母GS115 感受态中 , 涂布MD平板 , 30℃放置2d, 待长出单菌落后进行菌落PCR鉴定 , 引物同上。 1.Materials and methods 1.4 Expression of recombinant ancrod 将经菌落 PCR 鉴定为阳性的重组子分别接至2mLBMG培养基中 , 于 29℃、240 r/min 振荡培养24 h, 离心 , 用2m L BMM 培养基重悬菌体 ,于 29℃、240 r