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5. The SPL protein has sequence features of a transcription factor, and is localized to the nucleus. We do not know its DNA binding ability, so how can we test the hypothesis that SPL is a transcription factor? 答: (1)首先要检测该蛋白质是否的确能够特异性的结合某些DNA序列, 可以通过SELEX技术找到该蛋白质结合的DNA序列的特征, 或者用ChIP+PCR克隆该蛋白质结合的DNA片段并测序; (2)得到可能的结合序列后, 还应通过EMSA方法验证上述结合是存在的并且是特异性的. (3)一个蛋白质是转录因子的两个前提是: 一要能够结合特定DNA序列, 如上述; 二还要能够激活下游基因转录. 转录激活实验: 将结合序列克隆到luciferase报告基因的上游, 和该蛋白质编码质粒共转染细胞系, 看是否能够激活转录. 核酸类抗体（配基）的筛选过程称之为SELEX技术，其基本原理就是利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，其中随机序列长度在 20～40bp左右，文库容量在1014～1015之间。由于单链随机寡核苷酸片段特别是RNA易形成发卡、口袋、假节、G-四聚体等二级结构，能与蛋白 质、核酸、小肽、氨基酸、有机物，甚至金属离子结合，形成具有很强结合力的复合物。利用这一原理，将随机寡核苷酸文库与抗原或药物等靶分子相互作用，洗脱 筛选出特异寡核苷酸配基（aptemer），经RT-PCR及体外转录生成新的次一级文库，再与该靶子结合。反复数个循环，即可筛选出能与该靶子特异结合 的寡核苷酸片段（图1）。DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集与目的蛋白结合的DNA 片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，ChIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：ChIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；ChIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见，随着CHIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。凝胶电泳迁移率改变分析（EMSA）是目前研究转录调控蛋白和相应核苷酸序列结合的常用方法，但是由于许多转录调控蛋白有相似或相同的DNA结合位点，这种体外分析获取的结果不一定能真实地反映体内转录调控蛋白和DNA结合的状况。染色质免疫沉淀分析（ChIP）是基于体内分析发展起来的方法，它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。ChIP技术和芯片技术的结合有利于确定全基因组范围内染色体蛋白的分布模式以及组蛋白修饰情况。 凝胶迁移滞后实验（electrophoretic mobility shift assays，EMSA）是近年发展起来的研究核酸与蛋白质相互作用简单、快速、敏感的方法。目前已经成为转录因子研究的经典方法。其基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后（如下图所示）。该方法可用于检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋白，并可通过加入特异性的抗体（supershift）来检测特定的蛋白质，并可进行未知蛋白的鉴定。As you have learned in the signaling lecture, the Ras-MAPK pathway is also activated by growth factors. It has been shown that a full activation of this pathway requires stimuli from both cell adhesion and growth factors, in order allow the cells to enter the cell cycle. integrin介导信号通路的生理意义 Shc pathway对于cell proliferation以及migration中半桥粒的解体的作用在皮肤组织更新过程中，需要半桥粒的解体