信号芋螺毒管基因表达分析及几种芋螺多肽天然纯化、重组表达和活性鉴定.pdf

摘 要 芋螺是广泛分布在全世界热带海域的肉食性软体动物。芋螺毒液中结构独特 的活性多肽是其捕食、防御与竞争的主要武器。由于芋螺毒素可以高度特异地作 用于细胞膜上不同亚型的离子通道和神经递质受体，因而作为药理学研究的工具 得到广泛应用，其中的一些已经或有望被直接开发成药物用于疾病的诊断和治 疗。 本文以中国南海食虫性信号芋螺为研究对象，首次构建和系统分析了信号芋 螺毒管组织的cDNA文库；同时从该物种分离纯化了数十种天然芋螺多肽。在 此基础上，利用生物信息学、分子生物学、蛋白质化学以及电生理的技术和手段 展开了一系列的研究工作。 通过对文库克隆的随机测序和生物信息学分析，得到的897条有效ESTs序 列被聚成了305个基因簇。在获得的序列当中，有412条(对应于42个基因簇) 为毒素序列，约占总EST序列的45．9％。其中T．超家族芋螺毒素有222条EST 序列(14个基因簇)，在所有毒素成分中占据了主导地位，约占总芋螺毒素序列 的53．9％；此外，0．超家族和M．超家族芋螺毒素序列分布较多。研究表明不同 超家族毒素和各芋螺毒素基因的出现频率存在数量级的差异。通过序列比较发 现，毒素前体分子从N．端到C．端，变异数率依次递减；具有同一信号肽序列的 超家族可能衍生出多种不同半胱氨酸骨架的成熟肽序列。除了常见超家族成员之 外，文库中还发现了一个新的芋螺毒素超家族(L-超家族)和三个新的半胱氨酸 骨架。对于信号芋螺毒素基因表达情况系统全面的了解，不仅为新毒素基因结构 和功能研究的开展奠定了基础，还将有助于芋螺毒素分子多态性及其进化机理的 研究。 我们采用凝胶过滤、离子交换层析和高效液相色谱的方法从信号芋螺毒管中 分离纯化新的芋螺多肽。共获得约100余个芋螺多肽成分，我们对其中的72条 序列进行了MOLDI．TOF质谱分析，发现全部是新的芋螺毒素序列。选取其中的 十条序列进行Edman降解测序，其中六条与cDNA文库预测的序列相一致。本 文侧重研究了其中的两条序列lt3a和lt3b的结构及其功能。通过蛋白测序和结构 分析表明这两条序列存在谷氨酸羧化等新的翻译后修饰。膜片钳试验结果表明， 它们可以增加大鼠背根神经节钠离子通道的开放电流。这是首次发现可以增大钠 离子通道开放电流的芋螺毒素。 在新获得的毒素cDNA序列中，发现了两条全长O．超家族毒素序列——1163 与lt7．1(其编码的蛋白质分别命名为lt6c和lt7a)在理化性质上与作用于钠离子 通道的mu家族芋螺毒素接近，且序列上也具有较高的同源性。为了探明这两个 毒素的作用靶位及作用特点，我们利用基因工程手段，采用了pTRX表达系统将 lt6．3与It7．1成熟肽编码序列转入大肠杆菌进行了融合表达。实验优化了蛋白的 表达和纯化条件，最终获得了高纯度的重组毒素蛋白。利用飞行时间质谱对重组 蛋白进行物理性质的鉴定，结果显示毒素蛋白的分子量与预测结果相一致。同时， 膜片钳实验结果显示，这两种毒素均可以阻断电压敏感型钠通道而不改变通道的 激活与失活的动力学曲线，且这种作用具有浓度梯度依赖性。 通过对信号芋螺毒管cDNA文库的构建以及EST分析，深化了人们对芋螺 毒素基因表达特点的认识，从而有助于毒素分子功能以及进化研究工作的开展。 两种新的天然蛋白的获得及两种芋螺毒素体外表达的成功以及生理学活性的实 验结果，将为该毒素药用价值的开发和毒素与通道问构效关系研究的开展奠定坚 实的基础。 关键词：信号芋螺，芋螺毒素，表达序列标签(EST)，命名，进化，多样性 蛋白纯化，融合重组表达，膜片钳，钠离子通道 II Abstract Conusare ofmarine oneofthe extraordinarygenus gastropods．As largestsingle ofmarine allconesnailsknown genus invertebrates，almost todatearevenomousand utilizea co