调节性T细胞移植对实验动物脑缺血损伤的保护作用.pdf

UlIIIIIIIII llUlIII I UIIII 目 录 中文摘要……………………………………………………1 英文摘要……………………………………………………3 —)L——1一 日Ij舌…………………“…一“………一………一·…······…·5 材料与方法…………………………………………………7 结果…………………………………………………………16 讨论…···…………………………………………………．．．36 参考文献……………………………………………………40 附录： 致{射………………………………·……··……．．．．．…．．．．…44 综述： 中枢神经与外周免疫系统在脑缺血后的分子对话………45 万方数据 中文摘要 目的：脑缺血损伤可诱发强大的免疫炎症反应。免疫系统与缺血的脑组织之间的 相互作用参与了脑中风的病理形成，因而成为了中风治疗的一个新靶点。近期的研究提示 T CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+regulatory 节细胞，其功能障碍可加重脑缺血后的脑损伤，因此可能是机体对抗脑缺血损伤后脑内炎 症反应的一种内源性的自身保护机制。然而，目前尚未有研究对外源性给予调节性T细胞 静脉移植输注是否可对脑缺血损伤起到保护作用进行过评估。故本研究拟1)明确调节性 T细胞的静脉移植输注在啮齿类动物脑缺血模型中的神经保护作用； 2)探讨潜在的细胞 保护作用机制。 方法：免疫磁珠双重选择细胞提取法提取健康成年C57BL／6J小鼠及sD大鼠 分钟(小鼠)或120分钟(大鼠)后再灌注。将实验动物随机分为假手术对照组 72h对各组动物进行神经行为学评价， 染色或lIAP2免疫组化染色，计算机图像分析系统测量脑梗死体积。各组动物于静脉输注 调节性T细胞24h以及72h后经心脏取血并灌注后取脑制备脑组织冰冻切片，用免疫组织 化学方法染色检测外周免疫细胞在脑组织中的浸润。用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血 TGF—p表达水平的变化。为进一步探讨调节性T细胞所产生的神经保护作用，我们联合采 用了Gr一1抗体特异性消除中性粒细胞，删P一9基因敲除以及骨髓嵌合子技术以及体外 Treg与中性粒细胞的共培养技术。通过流式细胞仪分析外周免疫细胞评估Treg治疗对于 全身免疫功能的影响。 结果：在小鼠局灶性脑缺血模型中，MCAO后2、6或24小时后静脉输注提纯的调 节性T细胞可减少脑缺血后的脑梗死面积约50％，对神经功能的改善可持续至MCAO后28 天。MCAO后2小时给予Treg静脉输注治疗具有最显著的治疗效果，且在大鼠脑缺血模型 中也具有保护作用。值得一提的是脑缺血后Treg的有效治疗窗可长达24小时。在脑缺 万方数据 血后1天，脑内炎症反应、外周炎症细胞在损伤区脑组织内的浸润以及血脑屏障的破坏显 著减轻。 应用CD4S．1的同类系小鼠以及细胞示踪技术，我竹t京喜地发现Treg的神经保护作 用并不需要其浸润至脑组织内或抑制小胶质细胞的激活，提示其可能在外周循环中发挥保 除的骨髓转移至野生型经照射的小鼠体内都可消除Treg的神经保护作用，显示Treg是通 过抑制外周中性粒细胞来源的基质金属蛋白酶．9的产生，从而防止了血脑屏障的破坏。 Treg与中性粒细胞共培养的体外实验进一步证实了Treg是通过细胞间相互接触的方式抑 制中性粒细胞的MMP一9产生的。除了中枢神经保护作用以外，Treg治疗还显示出对中风 后低淋巴血症具有缓解作用，提示此治疗有望改善中风后的免疫状态。 紊乱为靶点的创新而有效的细胞治疗方法。调节性T细胞输注移植治疗通过抑常J#l-周中性 粒细胞MMP一9的产生保护了血脑屏障从而达到了早期的神经保护作用。 关键词：脑缺血再灌注；调节性T细胞；输注移植；基质金属蛋白酶一9；血脑屏 障；免疫