制备棉花高分子量线粒体DNA的方法.pdfVIP

Science2007，19(1)：74～75 棉花学报Cotton 制备棉花高分子量线粒体DNA的方法 of MolecularmtDNAfromCotton PreparationApproachHigh Weight 黄晋玲k2。胡建斌1’2，张锐1，郭三堆“ male mol·I．～Tris—C1， 细胞质雄性不育(cytoplasmicsterility，管中沉淀再用缓冲液B(0．05 0．3 mol·L1 CMS)是普遍存在于植物中的生物学现象。细胞 mol-I，～Sucrose，0．01 MgCl，，1％ 质雄性不育受核质两套遗传系统的控制，决定不 育的胞质基因在线粒体基因组中。高等植物的线 离心20min，弃上清液；将每管中沉淀再悬浮到 mol·L—Tris—C1，0．3mol· 粒体在小孢子的发育过程中起着重要作用，并且 缓冲液C中(0．05 与CMS密切相关。因此，通过构建线粒体基因 I。Sucrose，0．01 组BAC文库，克隆相关的线粒体基因，有助于了 工至终浓度30弘g·mL，37℃反应40min，以除 解CMS不育的机理。 去线粒体外的核DNA；用长针头注射器向管底缓 高分子量线粒体基因组DNA的制备是构建 缓注入20mL缓冲液D(0．01 高质量线粒体基因组文库的瓶颈。本实验室针对 0．6mol·L～Sucrose，0．002mol·I．1EDTA， 棉花本身富含棉酚、单宁和萜烯类等次生代谢物 pH7．5)，作成一个梯度，冰浴30min，然后16000 质的特殊性，借鉴其它作物的线粒体DNA提取 ×g离心20rain，弃上清液；沉淀再用20mI。缓 的方法，摸索出了一种提取棉花线粒体DNA的 冲液D同前一样悬浮、洗涤、离心2～3次，得到 既经济又能满足构建高质量线粒体基因组BAC 的沉淀即为纯净完整的线粒体。 文库的有效方法。 1．2．2胶块的制备。将plugmold置于冰上预 冷；用缓冲液D配制10mI，、1．5％低熔点琼脂糖 1 材料和方法 凝胶(LMP)，置于45℃水浴中备用；将装有线粒 1．1试验材料的准备 体悬浮液的离心管在45℃水浴中温浴5rain；向 将棉花晋A细胞质雄性不育系的种子经浓 线粒体悬浮液中加入等体积的1．5％低熔点琼脂 硫酸脱绒后，种在灭菌的营养土中，30℃黑暗培养 糖凝胶，温和混匀后，迅速用去枪尖的枪头将混合 6～10 mold d，收取黄化苗备用。 液加到于冰上预冷的plugmold中；将plug 1．2 高分子量线粒体DNA的制备 于4℃冰箱中冷却30min，以充分凝固。胶块凝 mmol·I．1 1．2．1线粒体的分离在操作过程中，质体通过 固后转移到裂解液(50 Tris—C1，l 低速离心被清除掉。经过差速离心和蔗糖密度梯 度离心获得高纯度的线粒体。整个操作必须在2 白酶K，终浓度为1mg·mL，于42℃温和振荡 ～4oC条件