实验五RNA的定量测定.pptVIP

RNA的定量测定 ——苔黑酚法（地衣酚） 1、实验目的 掌握苔黑酚法测定RNA含量的方法 2、重点与难点 实验原理 利用分光光度计测浓度时，对照的选择 3、实验原理 核酸的定量测定有:定磷法、紫外吸收法、苔黑酚法 DNA的定量测定：二苯胺法，脱氧核糖核酸中的2-脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在595nm处有最大吸收。DNA在40—400微克范围内，光密度与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。除DNA外，脱氧木糖，阿拉伯糖也有同样反应。其它多数糖类，包括核糖在内，一般无此反应。 DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成ω-羟基-γ-酮基戊醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物（λmax=595nm）。可用比色法测定。 DNA（脱氧戊糖基） HO—CH2—C—CH2—CH2—CHO ‖ 二苯胺 O蓝色化合物 苔黑酚法原理 从化学组成来说，RNA由碱基、磷酸和戊糖组成。在酸性条件下，戊糖转化成糠醛，其可与地衣酚生成绿色复合物，反应如下： 这种复合物在670 nm波长处有最大光吸收。当RNA的浓度10～100u g／ml范围内，其浓度与光密度值成线性关系。样品中少量脱氧核糖核酸(DNA)存在对测定无干扰，蛋白质、粘多糖在含量高时会干扰测定。 4、实验操作 4.1．标准曲线的制作 取6支试管，按下表1编号及加入试剂。 表l.制作RNA标准曲线时各试剂用量 试剂加完后，摇匀，置沸水浴中煮45 min。冷却后，在670 nm波长处测各管光密度值。以光密度为横坐标，每管标准液ml数为纵坐标，绘制标准曲线。 4.2．样品中RNA的测定 取2支试管，分别加入2.O ml样品液（1）、（2），各加2.0 ml地衣酚试剂，按标准曲线制作方法，测得光密度值后，折算成浓度。 注：样品液（2）即上次实验提取的酵母RNA。 5、本方法的干扰物及其去除方法 (1)戊糖或含戊糖的物质对本法有干扰；某些己糖也对本法有干扰（糖经浓无机酸脱水产生糠醛或糠醛衍生物，在浓无机酸作用下，与苯酚生成缩合物）；去除方法为，低浓度乙醇沉淀法和醋酸钾沉淀法，提高缓冲液中NaCl浓度也可；在高浓度钠钾盐中，通过苯酚-氯仿抽提可去除一些多糖（实际是去除糖蛋白）；用LiCl沉淀RNA，可将部分多糖留在上清液中。 (2)因不同时期酵母RNA含量有所变化，若样品光密度值均不在标准曲线范围，可减少加样品液量或增加RNA粗品溶液的浓度。 (3) 样品中蛋白质含量高时,应先用5%三氯乙酸溶液沉淀蛋白质后再测定. (4) 微量DNA无影响,较多DNA存在时,有干扰作用,如在试剂中加入适量CuCl2·2H2O可减少DNA的干扰,甚至某些已糖在持续加热后生成的羟甲基糖醛也能与地衣酚反应,产生显色复合物.此外,利用RNA和DNA显色复合物的最大吸收不同,且在不同时间显示最大色度加以区分,反应2min后,DNA在600nm显示最大吸收,而RNA在反应15min后,在670nm下呈现最大吸收. （5）苔黑酚-三氯化铁试剂需临用时配制，由于试剂中有浓盐酸，反应时 需加盖保险膜，防止盐酸挥发 6、原始数据 7、数据处理 7.1、标准曲线 7.2、样液（1）、（2）的浓度 7.3、 7.4、 8、问题 利用本法测定RNA的灵敏度高，但特异性差，有哪些干扰因素？如何排除？ * A670nm 100 80 60 40 20 0 浓度（ug/mL） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 地衣酚试剂(m1) 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水(m1) 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0 RNA标准液(m1) 5 4 3 2 1 0 样液（2） A670nm 样液（1） 5 4 3 2 1 0 管号 * * * DNA和RNA都有吸收紫外光的性质，它们的吸收高峰在260nm波长处。吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性，核酸和核苷酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用E（P）来表示，E（P）为每升溶液中含有一摩尔原子核酸磷的消光值（即光密度或称光吸收）。RNA的E（P）260 nm（pH7）为7700—7800。RNA的含磷量约为9.5%，因此每毫升溶液含1微克RNA的光密度值相当于0.022—0.024。小牛胸腺DNA钠盐的E（P）260 nm（pH7）为6600，含磷量为9.2%，因此每毫升溶液含