PCR方法检测河豚鱼的引物筛选及反应体系优化.pdfVIP

3 76 2010, Vol. 31, No. 20 食品科学 ※分析检测 PCR方法检测河豚鱼的引物筛选及 反应体系优化 1 1, 2 1 1 1 1 2 陈文炳 ，赵 晨 ，邵碧英 ，江树勋 ，闫 诚 ，李寿崧 ，林河通 (1.福建出入境检验检疫局，福建福州 35000 1；2 .福建农林大学食品科学学院，福建福州 350002) 摘 要：根据Genbank 公布的河豚鱼细胞色素b 基因序列，应用软件Primer Premier 5.00 版设计了7 对引物，经过 PCR 筛选，确定可以在所有8 个供试河豚鱼样品中检出目的DNA 片段的引物HT- 1，用于建立河豚鱼的PCR 检测 方法。对该P CR 方法中6 个因素包括退火温度、Mg2+ 终浓度、Ta q DN A 聚合酶用量、dN TP s 终浓度、引物终 浓度和模板DNA 用量进行优化，确定优化的PCR 扩增体系：10 ×PCR 缓冲液2 μL ，MgCl2 终浓度1.5mm ol/L ， Taq DNA 聚合酶1.0U ，dNTPs 终浓度300 μmol/L ，引物终浓度0.2 μmol/L ，DNA 模板4 00n g ，加纯水至总体积 20 μL 。扩增程序定为94 ℃预变性5min ，94 ℃变性30s，62 ℃退火30s，72 ℃延伸30s，40 个循环，72 ℃延伸5min 。 据此建立河豚鱼成分PCR 检测方法，并通过河豚鱼与非河豚鱼的PCR 检测结果比较，验证了该方法的河豚鱼特异 性。研究结果还表明，该方法的检出限为0. 1% ，含量为0 .1% 的河豚鱼样品P CR 检出率至少在97.5% 以上。 关键词：河豚鱼；引物筛选；P C R 检测；优化 Primer Screening and Optimization of PCR System for the Detection of Puffer Fish 1 1,2 1 1 1 1 2 CHEN Wen-bing ，ZHAO Chen ，SHAO Bi-ying ，JIANG Shu-xun ，YAN Cheng ，LI Shou-song ，LIN He-tong (1. Fuj ian Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Fuzhou 35000 1, China ； 2. College of Food Science, Fuj ian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China) Abstract ：According to the sequence of cytochrome b gene of puffer fish published in GenBank, seven pairs of puffer fish- specific primers were designed with Primer Premier 5.00 version. After PCR screening, the primer HT-1, which could detect the target DNA fragment in eight samples of puffer fish from different aquatic breeding farm in Fuj ian province, wa