Ⅱ型胶原C端肽单克隆抗体制备及鉴定.pdfVIP

生堡撞墼匿生銎盍!!盟生12爿筮!Q鲞星!!塑￡!坐』!些丛生：些堂些竺!螋!：型!!，盟垡!! 1389 基础实验诊断研究 Ⅱ型胶原C端肽单克隆抗体制备及鉴定 赵丹慧张励力蓝钒王娜袁越张砚卓 【摘要】目的 制备Ⅱ型胶原c端肽中EKGPDP多肽片段(谷氨酸一赖氨酸-甘氨酸-脯氨酸-天 采用戊二 冬氨酸-脯氨酸)的单兑隆抗体(McAb)，并进行抗体的纯化、鉴定及初步临床验证。方法 hole 醛法制备EKGPDP一钥孔嘁血蓝素(k。ylimpethemo。y舢n，KLH)抗原载体复合物。腹腔及静脉攻 击法免疫BALB／c小鼠8只：按常规方法将小鼠骨髓瘤细胞和免疫小鼠脾细胞融合。筛选阳l生克隆 株．以有限稀释法克隆3次。对杂交瘤细胞株的染色体、亲和力、类型和稳定性进行鉴定，取其中亲和 力较高的6株制备腹腔积液，用盐析及蛋白G琼脂糖凝胶珠层析法纯化抗体。对McAb的纯度、特异 性、交叉反应性及免疫活性进行鉴定。用免疫组化法对骨性关节炎膝关节软骨和椎间盘软骨样品进 行分析。，结果 本研究获得13株能高效分泌特异性McAb的杂交瘤细胞株；经5个月传代35代和 1× 8×104(EKG7)、5 反复冻存复苏6次，培养上清稳定性良好。6株McAb腹腔积液效价分别为2 l 103(EKGl4)、51×105(EKGl6)、51×】o’(EKGl8)、5x105(EKc25)、32×104(EKG28)。电泳结 果证明，盐析法纯化腹腔积液得到的单克隆抗体回收量、活性、存放1周后活性分别为8．07 mg、3．35 (A。。)、3．10(A。。)，蛋白G亲和层析法得到的单克隆抗体回收量、活性、存放1周后活性分别为0．32 1119、1．83(A。，。)、o 66(A。，。)，盐析法优于蛋白G亲和层析法(f=25．26，P0．01)。抗体的最佳应用浓 度为(50一150)¨∥L。临床初步鉴定发现，6株EKGPDP单克隆抗体在骨性关节炎及突出椎间盘软 骨标本中出现了不同程度的阳性结果。结论 本研究成功获得抗Ⅱ型胶原c端肽片段McAb，为Ⅱ 型胶原降解产物的测定提供了研究工具。 【关键词】胶原Ⅱ型；抗体，单克隆；标本制备 and characterizat-0n0fm佃OdOnalan“bodies C-tem“nal 0f Pmp删on typeⅡ against telopep廿des z品40 coua肿n DⅡn．九越+，z础ⅣG工i—E“Ⅳ几n，聃^峪Ⅳ。．y瑚Ⅳ№．z础ⅣG№n．出Hn ‘日e彬愕胁“觚eD，‰ummD2啊r o以OH^叩傩d如，B咖几g^跏越儿n舶妒i础，＆洳憎』DD∞5，蕊抽n CDr，℃spo蒯i蚪n“￡抽‘：Z删0mn一^“i，‰“：舭如础“i@26iMf To andv枷date objecⅡve antibodies(McAb) 【Abstr挑t】 p‘印are，pu试fy 8pec击cmonodonal inc—te瑚inal 0f clinlcal 89且i璐t collagentypeⅡ(EK(讲DP)for