小G蛋白StRac在马铃薯抗晚疫病过程中的功能的研究.pdf

摘 要 与其下游元件共同作用可以调控肌动蛋白的动力、细胞形态建成、细胞极性的生 成、细胞凋亡、细胞分化、活性氧产生等多种生命活动。马铃薯晚疫病是由致病 疫霉侵染而引起的一种毁灭性病害。本研究从马铃薯中克隆至lJd,G蛋I刍StRac，通 过超量表达和内源StRac基因的沉默研究StRac在马铃薯抵抗晚疫病菌侵染过程 中的功能，具体的研究结果如下： 1．利用烟草中已经克隆到的dG蛋I兰tNtRac4的保守区设计简并引物，采用 StRac 同源性是99％。StRac翻译后可得至wJ211个氨基酸，分子量为23．29KD。蛋白二级 结构预测结果表明StRac蛋白有1个效应子结合区，1个鸟苷酸交换因子结合区 Box区域。这些结构域以B折 l卜M92+离子结合效应区，还有2个交换区和5个G 叠和0【螺旋的形式存在于StRac蛋白的二级结构中。利用软件EXPASY对其蛋白二 级结构的保守功能域进行预测，发现从2．179氨基酸位置有一个保守的Rho功能 域，这也预示着StRac和Rho家族的dxG蛋白的具有相似的功能。 2．StRac在马铃薯中表达谱的研究结果表明在不同马铃薯品种中StRac的表 达量存在差异，夏坡蒂(XPD)中StRac的相对表达量最高，其次为虎头(HT) 中的相对表达量最低。同一品种的不同组织中StRac的表达谱也存在差异，在幼 嫩叶片中表达量最高，其次为老叶片，茎中表达量位居老叶之后，根中的表达量 最低。 3．利用GFP标签进行亚细胞定位的结果表明，不论是在烟草的表皮细胞还是 马铃薯的悬浮细胞，StRac蛋白主要定位于细胞膜上。 4．农杆菌介导的瞬时表达的结果表明：在瞬时表达CAStRac(激活型)位点接 瞬时表达位点病斑小的原因是由于H202在此位点的大量积累。这一结果预示着 StRac在调控马铃薯抗晚疫病过程介入了H202信号分子。 5．为了进一步确定StRac在马铃薯抗性建立过程中的功能，我们通过农杆菌 介导的方法得到转基因马铃薯。经过PCR、RT．PCR、蛋白免疫印迹检测，确定 获得转基因植株中能够稳定表达StRac基因。对转基因植株的不同株系接种晚疫 坏死细胞染色的结果表明CAStRac转基因植株叶片接种后坏死细胞数量明显小 果预示着超表达CAStRac月…够提高马铃薯对晚疫病菌的抗性。 6．为了解析超表达CAStRac能够提高马铃薯对晚疫病菌的抗性的原因，我们 首先检测了不同转基因植株接种前后H202的积累。DAB染色的结果表明接种后 照(p1 因的转录水平均呈现出先升高后降低的趋势，并在48h表达出现峰值。而DNStR口c 植株接种后SOD、A剧吸CA瑾因转录水平均呈现出降低的态势。StRac(野生型) 近，均为先降低后升高，但是峰值点均低于CAStRac转基因植株。 7．为了更迸一步的确定StRac在马铃薯抗性建立过程中的功能，我们构建了 StRac和内参基因p凼的病毒沉默载体。利用内参基因p凼优化了病毒介导的基因 沉默的接种方法和比较了沉默载体在不同马铃薯品种中的沉默效率。利用优化的 沉默体系对乌盟601中StRac进行了沉默。通过人工接种检测沉默植株对晚疫病的 抗性水平的结果表明接种晚疫病后，StRac沉默的叶片上病斑面积扩展速度明显 快于野生型叶片，预示着StRac在马铃薯抗晚疫病过程中具有正向的调控作用。 关键词：d,G蛋白StRac；马铃薯抗性；马铃薯晚疫病；基因沉默 The onthefuncionofSmallGProteinStRaconthe study resistanceestablishmentto late potatoblight Abstract Small monomeficnucleotide relatedto GTPases，are guanine bindingproteins thesubunitofheterotrimericG haveshownthatsmallG proteins．Stu