促红细胞生成素对视网膜神经元缺氧损伤的保护作用体外及研究.pdf

Y908788 中文摘要 促红细胞生成素对视网膜神经元缺氧损伤保护作用的体外研究 中文摘要 目的：研究如何使视网膜神经细胞避免损伤或死亡即神经保护，是眼科学基础 中枢神经系统的损伤后的生存、修复及预后有明显保护作用。本实验建立新生大鼠 视网膜神经元细胞原代混合培养体系和Mnller细胞传代培养体系，分析EP0及EP0 受体在正常视网膜神经元细胞以及低氧诱导时的表达，观察缺氧损伤对培养的视网 膜神经元的影响，并探索EPO对神经元损伤的保护作用及机制，为EP0在视网膜疾 病中的应用奠定理论基础。 方法：将wistar乳鼠视网膜通过胰蛋白酶+依地酸(EDTA)消化，制成视网膜 单细胞悬液，建立一种稳定、可靠的视网膜神经元体外培养体外培养的方法，并用 免疫细胞化学技术对视网膜神经元进行鉴定。低浓度氯化钴预处理对视网膜神经元 进行低氧预适应，之后制作细胞急性缺氧模型。MTT检测评价视网膜神经元急性缺氧 损伤和低氧预适应后细胞的活力改变。采用反转录．PcR(RT—PcR法)、免疫细胞化 学方法检测EP0及EPO受体在正常视网膜神经元细胞以及低氧诱导时的表达；从细 胞形态学、L叫释放量等形态学和生化指标，观察不同浓度rhEP0预处理对视网膜 缺氧损伤的保护作用。TuNEL染色检测视网膜神经元的凋亡，并进行形态学观察和对 照。此外，采用机械震荡、吹打法培养和传代视网膜Muller细胞，3～4代的细胞 和蛋白的表达变化进行了检测。 结果：在多聚赖氨酸上培养的视网膜神经元免疫细胞化学染色显示，培养的 细胞大多数抗NF抗体反应阳性，NF阳性神经元所占总数神经元的9096以上。体外 培养的正常视网膜神经元有EPOR的表达。低氧预适应后经半定量赆PcR分析，EP0 基因表达在1h达最高峰，以后随时间的延长迅速下降，6h下降到接近正常的水平； 而EPOR的表达在2h达到最高峰，约为正常对照组的4—5倍，以后虽然出现下降趋 势，但仍一直维持较高水平，提示低氧预适应后可上调神经元EPO、EPOR表达，这 司‘能是机体发生内源性视网膜保护的机制之一。同时，证实了外源性应用重组人促 红细胞生成素(rhEPO)预处理对神经元的缺氧损伤具有保护作用，在损伤前加入 中文摘要 时间依赖性；TUNEL结果显示rhEPO预处理能抑制神经元的凋亡。此外，成功获得 视网膜Muller细胞，传代后的细胞GFAP染色表现为胞浆内呈棕黄色的丝网状结 构，阳性细胞在95％以上，并发现在正常的视网膜Mnller细胞中仅见微弱的EP0 mRNA和蛋白表达，而缺氧后表达明显上调，这种上调呈时间依赖性。 结论：通过胰蛋白酶十EDTA联合消化能很好得使视网膜细胞分离，视网膜神经 元体外培养成功，并有较好的视网膜神经元生长。体外培养的正常视网膜神经元有 EPOR的表达，低氧预适应后能够明显上调视网膜神经元EPO和EPOR表达，从而 增强视网膜神经元对急性缺氧损伤的耐受能力。rhEPO预处理抑制神经元的缺氧损 伤导致的细胞凋亡，而且其神经保护作用具有浓度和时间依赖性。Muller细胞在缺 氧条件下EPo表达水平的升高可能是缺氧性视网膜病变的神经保护因素之一。 博士研究生 刘夫玲(眼科学) 指导教师 牛膺筠教授 关键词：促红细胞生成素：视网膜；神经元；缺氧；细胞培养； 英文摘要 EFFECTS0F NEUROPROTECTIVE RATRETINALNEURONSHYPOⅪA (EPO)ON INJUlUES thatcommoncharacterof some Recentstudiesindicates Objective