一种可视型分子筛体系的构建及其亮氨酸拉链作为影响蛋白构象工具的初探.pdfVIP

Establishmentofa visible filtration and gel chromatography studiesonleucineasatoolto preliminary zipper changeprotein ADissertation Submittedtothe Committeeof Normal Zhejiang University Forthe of Degree MasterofScience ByZhangWenqiang Prof．SunMeihao Supervisedby May，2014 万方数据 本研究得到国家自然科学基金 107005 (3 5)基金项目资助 TheResearchwas theNationalNaturalScience Supportedby FundofChina 万方数据 一种可视型分子筛体系的构建 及亮氨酸拉链作为影响蛋白构象工具的初探 摘要 分子筛层析是蛋白分离纯化或者蛋白分子量测定的一种常用方法。它利用有 筛孔的球状凝胶为固定相，分子量较大的蛋白无法进入筛孔中，所行路径较短流 出较快，分子量小的蛋白因进入筛孔，行程较长最后流出，从而能够依据蛋白分 子量的大小来分离、分析蛋白质。这种层析技术不仅被广泛应用于科学研究，也 是各生物类院校对本科生和研究生安排的生化实验。 利用各类荧光蛋白具有不同颜色的特性，我们将不同颜色RFP、CFP、YFP、 GFP四种荧光蛋白基因排列组合，构建到原核表达载体中，通过亲和层析，纯化 kDa， 得到一系列分子量大小不同颜色各异的蛋白。其中，红色RFP大小26．9 橘色的RC大小54．9kDa，粉色的ⅥW大小84．3kDa，绿色的PKII．GFP大小 168．1 kDa(大肠杆菌丙酮酸激酶PKII为二聚体)。所得融合蛋白均有较好的可溶 性和较强稳定性，颜色差异比较明显，无需光照、激发等其他外界条件。后经过 200)分离检测，结果显示，蛋白上柱后可视效果明显，条带 分子筛(superdex 区分较清晰，证实纯化的蛋白可以作为可视的分子筛Marker使用。本研究不仅 扩宽了荧光蛋白的应用范围，同时也对分子筛层析的实验教学工作有所帮助。 分子筛分离蛋白时，除与蛋白质分子量大小有关，还与蛋白质的形状有关。 蛋白接近球形时其效果最好。上述四种可视分子筛Marker均为链状蛋白，在应 用时有缺陷和局限性，若想这些分子筛Marker有更精确的效果，我们需要寻找 一种能够改变蛋白构象的工具。 为分析亮氨酸拉链作为影响蛋白构象的工具，我们设计正反两个走向的亮氨 蛋白经3C蛋白酶充分酶切后，进行FRET检测