CRISPR-Cas9系统定向编辑TCR基因的sgRNA筛选.pdfVIP

　 第20卷　 第4期 集美大学学报 (自然科学版) Vol.20　 No.4 　 　 2015年7月 Journal of Jimei University(Natural Science) Jul． 2015 [文章编号] 1007-7405(2015)04-0265-06 CRISPR-Cas9 系统定向编辑TCR基因的sgRNA筛选 1,2 1,2 1,2 1,2 3 1,2 邵红伟 , 陈　 辉 , 彭　 鑫 , 徐　 畅 , 张广献 , 黄树林 (1. 广东药学院生命科学与生物制药学院, 广东广州510006;2. 广东省生物技术候选药物研究重点实验室, 广东广州510006; 3. 广州中医药大学基础医学院, 广东广州510006) [摘要] 为构建靶向T细胞抗原受体 (T Cell Receptor, TCR) 基因的CRISPR-Cas9基因组编辑系统, 基于pX458质粒构建靶向TCR基因β链C区的CRISPR-Cas-sgRNA质粒, 将其转染HepG2细胞系, 用流 式细胞术检测转染效率; 转染48 h后提取 HepG2 细胞基因组 DNA, 扩增含有编辑位点的片段, 测序分析 该片段的峰图改变; 对出现双峰的扩增片段做T -A克隆后测序分析, 确定基因编辑发生的位置, 并结合 转染效率计算基因编辑效率. 结果表明, 成功构建含有3种sgRNA序列 (N1、 N2、 S1) 的pX458-sgRNA 质粒, 其转染效率分别为38．5% (N1)、 39．7% (N2) 和24．2% (S1); 基因组PCR产物测序分析发现, S1组扩增片段在打靶位置出现杂峰; T -A克隆测序发现, 20 克隆有4 个发生了基因编辑 (20%), 结合 转染效率 (24．2%) 可知, 编辑效率约为83%. 可见, 本文成功构建靶向TCR 基因的CRISPR -Cas - sgRNA质粒, 并鉴定出基因编辑效率较高的一种sgRNA序列. [关键词] T细胞抗原受体; 靶向; CRISPR; 基因组; 编辑 [中图分类号] R392．11 [文献标志码] A Selection of sgRNA for Efficient Editing of TCR Gene by CRISPR-Cas9 System 1,2 1,2 1,2 1,2 SHAO Hong-wei , CHEN Hui , PENG Xin , XU Chang , 3 1,2 ZHANG Guang-xian , HUANG Shu-lin (1. School of Biosciences and Biopharmaceutics, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou510006, China; 2. Guangdong Province Key Laboratory for Biotechnology Drug Candidate, Guangzhou510006, China; 3. School of Basic Medical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou510006, China) Abstract: To establish a TCR-targeted CRISPR-