鲫鱼血清中可溶性瘦素受体的检测.pdf

THE IDENTIFICATIONOFTHE SOLUBLELEPTIN RECEPTOR IN CRUCIANCARP JIiiiirl i iiiIiiiiiiiii iil Y2414691 ADissertationin Zoology Underthe ofProfessor Supervision CAOYibin By XUEJunfian Normal Zhejiang University Jinhua，Zhejiang，China May,2013 鲫鱼血清中可溶性瘦素受体的检测 摘要 瘦素(Leptin)是一种具有多种生理功能的神经免疫内分泌调节激素，由 D6基因编码，由脂肪组织分泌进入血液，与一种短型受体结合后随血液循 环跨过血脑屏障进入下丘脑，与特异性的瘦素受体(LPR)结合，通过激活 某些特定的信号传递途径来抑制进食、增加能量消耗，此外还可通过与外 周组织的瘦素受体(LPR)结合影响脂肪的分解合成和胰岛素抵抗等一系列 机体代谢过程。因此，LPR对进一步发挥Leptin的生理功能起重要作用。 LA于1995年运用表达克隆法首次从小鼠脉络丛cDNA表达文库中 Tartaglia 克隆出LPR，随后在鸟类和两栖动物中均己发现LPR。在硬骨鱼类中，最早 别在河豚、日本青鳊、斑马鱼、大西洋鲑鱼、石斑鱼和黄颡鱼中克隆-了Leptin 长型受体的完整编码区，并从基因组定位、组织分布和发育表达调控等角 度进行了初步研究。总体而言，目前关于鱼类瘦素受体的研究还很少。 mM IPTG条件下诱导表达，经 隆到表达载体pGEX．4T．2中，在37℃、1 体形式存在，表达量及可溶性几乎不受IPTG浓度变化的影响，但对温度 的变化很敏感，随温度降低，表达量也大大减少。用8M尿素对包涵体进 行变性处理，同时采用稀释复性和缓慢透析的方法使融合蛋白溶解，溶解 T 摘要 的融合蛋白不能与GSTResin结合，可能是其没有完全恢复天然状态的构 象。为此选择了标签较小的表达载体pET32a(+)，经诱导发现在温度为 25℃，IPTG浓度为0．1 mM时，重组融合蛋白Trx．Leptin可溶性表达， 可以用于Pull．down检测鲫鱼血清中的可溶性瘦素受体(sLR)。 为了检测鲫鱼中的瘦素受体，根据鲫鱼Leptin长型受体胞外区第 血液，获得了相应的多克隆抗体，纯化后运用ELISA法检测抗体滴度， 同组织中瘦素受体的表达水平，其中Anti．LPI‰3-216几乎检测不到信号， 可能是该抗体不适用于Western 鱼肝脏中瘦素受体表达量明显高于鳃和肌肉，且在肝脏中检测到了瘦素受 kD。 体的两种亚型，分子量分别约为110kD