五氯酚对稀有鮈鲫内分泌毒性及遗传毒性与研究.pdf

摘要 a i! 曼蔓曼!曼曼曼曼曼曼曼!曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼曼!曼曼曼曼曼!曼曼曼曼曼罡曼皇曼鼍曼!曼曼曼!曼曼曼!曼曼!皇曼曼曼曼ii_曼曼曼 五氯酚对稀有绚鲫内分泌毒性及 遗传毒性的研究 生物化学与分子生物学专业硕士研究生 马永鹏 指导教师刘堰教授 捅要 能，并具有致畸、致癌、致突变作用，是环境内分泌干扰物质中具有代表性的物 质，其化学性质比较稳定，易富集于沉积物中，不易降解，在环境中的残留量相 对较高，因此当它作为杀虫剂、防腐剂等在世界范围内广泛应用时，也就造成了 严重的环境问题。目前鉴于其雌激素内分泌干扰毒性和遗传毒性对水生环境和水 生动物的危害，以及在这些问题上存在的争议。本研究选择稀有觞鲫(Gobiocypris rarus)作为指示生物，在胚胎个体、组织器官、细胞和分子水平上研究了PCP对 稀有绚鲫的雌激素内分泌干扰毒性和遗传毒性，为建立快速、有效、实用的内分 泌干扰物的生物监控和测试技术提供了基础资料。其研究内容包括如下几部分： 1．将稀有觞鲫暴露在不同浓度的PCP溶液中，利用组织病理技术分别在第7、 14、21、28d时观察稀有觞鲫鳃、肾脏、肝脏和性腺组织的病理变化。结果显示， 鳃组织出现上皮细胞坏死、上皮增生、上皮水肿及脱落、出现动脉瘤和鳃小片之 间的融合等损伤。肾脏出现肾小管、集合小管上皮细胞不同程度的肿胀、变性坏 死，肾小囊腔相对扩大，肾小球退化，出现嗜酸性分泌物等变化。肝脏表现出肝 脏细胞肥大、细胞混乱、肝细胞细胞核增大和糖元消耗，同时还有大量嗜酸性物 质储存的症状。雄鱼的精巢严重退化，成熟精子消失，只有成簇的初级、二级精 原细胞，同时出现了精巢卵巢中间体和嗜酸性分泌物；雌鱼卵巢严重退化，成熟 卵黄蛋白原细胞和闭锁卵细胞消失，只有初级卵黄蛋白原卵母细胞，在阳性对照 EE2染毒组中还出现大量嗜酸性分泌物。结果表明PCP具有显著的组织损伤毒性 和雌激素样内分泌干扰效应。 2．选用稀有绚鲫成鱼的卵黄蛋白原(VTG)为雌激素污染物的生物标志物，选 五氯酚(PCP)的雌激素效应并确定其卵黄蛋白原的分子量。研究结果表明，静态 暴露21d后，五氯酚处理的稀有觞鲫雄鱼体内生成微量VTG，而雌鱼变化不明显； 确定卵黄蛋白原(VTG)两亚基的分子量分别为120kDa和103kDa。 3．利用兼并引物扩增出稀有觞鲫VTG和p53基因的部分片段，与斑马鱼等多 曲商大学硕十学传论文 种鱼的全基因序列比对发现相似度分别在93％和80％以上。利用此片段，通过 性。结果表明，PCP能显著诱导稀有约鲫肝脏VTG和p53基因的表达，并显示出 极好的剂量效应和时间效应关系：但是，与阳性对照EE2相比诱导效应微弱，说 明PCP的雌激素内分泌干扰效应相对较弱。综上，PCP具有雌激素性质和致癌性， 也表明稀有绚鲫VTG和p53适合作为监测环境EDCs的理想生物标志物。 4．用单细胞凝胶电泳(SCGE)技术，研究了在不同的染毒时间内不同浓度的五 氯酚(PCP)对稀有绚鲫血细胞和肝脏细胞DNA的损伤。结果显示，各PCP染毒组 较，差异极显著(PO．05)。随着浓度的增加，细胞彗星尾部％DNAT和TL逐渐增 加，其相关系数o．926，说明在实验浓度范围内，存在显著的浓度．效应关系。在 同一浓度下，随着暴露时间的增加，处理组％DNAT和TL逐渐增加，存在显著的 时间．效应关系。由于PCP可引起稀有觞鲫血细胞和肝脏细胞DNA的严重损伤， 因此稀有绚鲫血细胞和肝脏细胞DNA的损伤可作为PCP遗传毒性的生物标志物。 5．采用稀有绚鲫胚胎发育技术，对五氯酚的毒性在胚胎个体水平上进行测定， 结果表明，PCP对胚胎发育有明显的抑制作用，会造成胚胎发育的畸形或死亡，不 同时间染毒产生的可观察毒理学终点各异；随着PCP作用浓度的加大，稀有觞鲫 胚胎的孵化率、相对成活率逐渐降低，畸形率增加，显示显著的剂量效应关系。 综上，稀有绚鲫胚胎发育技术可作为评价内分泌干扰物毒性的一个指示器。 关键词：五氯酚，稀有觞鲫，内分泌干扰物，遗传毒性，胚胎发育，real．time PCR，单细胞凝胶电泳，组织病理切片