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PacBio RS II 第三代单分子实时测序 2014-04 上海市浦东张江高科蔡伦路103 号A1 座2 楼 2rdFloor,A1 Building,No.103 Cai Lun Rd,PuDong,Shanghai 电话：021传真：021 Tel ：021Fax：021 PacBio RS II 单分子实时测序系统具有超常读长、组装结果高准确度、可检 测碱基修饰等优势特点，可广泛应用于基因组测序、甲基化测序、全长转录本测 序等项目。详见：/zh-CN/hanyumarketing/e3/e3.html PacBio RS II 单分子实时测序原理 PacBio RS II 单分子实时测序 （single molecule, real-time ，SMRT）测序反应 是在其专利SMRT cell 中进行的，每个SMRT cell 中有150,000 个ZMW （纳米 级的零模波导孔zero-mode waveguides ）,每个ZMW 都能够包含一个DNA 聚合 酶及一条DNA 样品链，SMRT Cell 能够平行检测大约75,000 个单分子测序反应。 当测序进行时，专利的包被技术保证DNA 聚合酶和模板形成的复合体被锚 定在 ZMW 的底部，反应溶液中带有标记着不同荧光磷酸基团的高浓度核苷酸， 检测装置则透过ZMW 底部的基层来实时观察 DNA 的合成过程，不同荧光标 记的脱氧核苷酸被掺入DNA链时，其荧光可在DNA链检测到，根据光的波长与 峰值可判断进入的碱基类型。 图 1 PacBio RS II 测序原理示意图 专利DNA 聚合酶不受激光对其造成的损伤及核苷酸标记荧光影响，可较长 时间保持酶活性，实现超长读长，且当荧光标记的脱氧核苷酸与DNA链形成化 学键时，DNA聚合酶可切除其荧光基团，荧光消失。ZMW外径比检测激光波长 小，激光从底部打上去后不能穿透小孔进入上方溶液区，能量被限制在一个小范 上海市浦东张江高科蔡伦路103 号A1 座2 楼 2rdFloor,A1 Building,No.103 Cai Lun Rd,PuDong,Shanghai 电话：021传真：021 Tel ：021Fax：021 围(体积20X 10-21 L)里,正好足够覆盖需要检测的部分，使得信号仅来自这个小反 应区域，孔外过多游离核苷酸单体依然留在黑暗中，从而实现将背景降到最低。 相机以15ms速度快速扫描整个阵列，检测特异性结合到DNA片断上的荧光碱基。 此外，PacBio RS II测序可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，来检 测一些碱基修饰情况，如果碱基存在修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，相邻 两峰之间的距离增大，可以通过这个来之间检测甲基化等信息。 PacBio RS II 测序优势 单分子测序建库不经PCR 扩增，精巧的ZMW 设计有效将背景干扰降到最 低