大鼠骨髓间质干细胞在心肌梗死及心力衰竭中应用的实验研究.pdf

郑州大学2004年硕士论文 大鼠骨髓间质干细胞存心肌梗死及心力衰竭中应用的实验研究 大鼠骨髓间质干细胞在心肌梗死及 心力衰竭中应用的实验研究 研究生 赵健 导师 高恩民 河南省人民医院心血管内科郑州450003 摘要 心血管系统疾病，特别是心肌梗死，是人类致病致死的主要原因。随着人口 老龄化和梗死后存活率的提高，充血性心力衰竭的发病率及流行性不断增加。目 IV 前内科药物治疗仅仅缓解症状，不能从根本上挽救濒死心肌，最终导致NYHA 级患者1年死亡率达到60％。尽管心脏移植是目前唯一彻底治疗心力衰竭的方 式，但器官短缺、技术等因素限制其广泛应用。在成体心脏终末分化的心肌细胞 已证实存在有丝分裂，但其增殖率很低，不能满足组织再生的需要。因此，最现 实的方法是向梗死部位提供大量的有收缩功能的细胞——心肌细胞成形术。 心肌细胞成形术主要针对于弥补心肌细胞数量的不足，基于两种假设：(1) 充血性心力衰竭是由于大量心肌细胞不可逆性坏死造成：(2)心功能可以通过大 量有收缩功能的细胞替代坏死心肌而改善。在此前提下，大量研究证实骨髓间质 干细胞在5一aza体外诱导下可定向分化为心肌细胞，并表达心肌特异性蛋白标 移植于心肌梗死部位后能否存活，并分化为心肌细胞，改善心脏功能等问题国外 有相关报道，国内报道较少。 本实验目的：(1)骨髓间质干细胞体外培养扩增的可行性；(2)移植的骨髓 间质干细胞能否在心肌梗死部位存活；(3)移植于瘢痕部位的干细胞在心肌微环 境下能否表达心肌特异性蛋白标志，横向分化为心肌样表型；(4)是否改善梗死 大鼠的心功能状态。 郑卅『大学2004年硕士论文 火鼠骨髓问质干细胞在心肌梗死及心力衰竭中应用的实验研究 材料与方法： l，大鼠骨髓闯质干细胞的准备：取大鼠腹腔麻醉，用含10％胎牛血清的 和脂肪，PBS液洗涤3次。用含10％胎牛血清、青霉素(100U／m1)、链霉素 3002)． 置于37C，5％C02，95％湿度培养箱中。24小时首次换液去除悬浮生长细胞， 以后每隔3天换液一次．倒置显微镜下观察细胞的形态及生长状况。细胞约80％ 融合时，弃去皿内培养液，用PBS液洗涤3次，加入0．25％胰蛋白酶消化，接种 到3个培养皿中(首次传代)当第二次传代的细胞接近80％融合时，5一aza加 入培养液中24h，终浓度10pmol／L。为鉴定移植于心肌瘢痕中的异体细胞，移植 前进行细胞标记，将BrdU加入培养液共孵育48h，终浓度O．1mg／ml培养液。 2．大鼠心肌梗死模型的制作：取成年大鼠，腹腔麻醉，气管插管，正压通 气，80次／分钟。大鼠左侧开胸1．5cm，打开心包，暴露心脏。8一O无损伤缝线 结扎左冠状动脉回旋支，待局部心肌颜色苍白后逐层关胸。 3．骨髓间质干细胞的移植：心肌梗死后2周，大鼠麻醉，心脏暴露如前。 0,25％胰蛋白酶消化贴壁生长的骨髓阀质干细胞，用含10％胎牛血清的 验组大鼠心梗部位(n-12)，并用8-0无损伤缝线“c”形结扎进针口，关胸及术后 护理。培养液对照组(n=9)、PBS对照组(n=9)操作同上。 4．超声学评价心功能：心肌梗死后2周大鼠麻醉，12MHz高频探头于乳头 肌水平记录左心室二维超声心动图。超声学评价其心功能状态，计算Fs％； 5．免疫组织化学：心脏固定、石蜡包埋。心肌梗死部位连续切片，厚度5p m，行髓染色和免疫组织化学染色。 6．统计学分析： SPSSl0．0统计软件处理数据，样本均数用z±s表示，显 著性水准为双侧a=O．05。 结果： 1．大鼠骨髓间质干细胞的培养：细胞接种培养皿24h后，镜下观察大量悬 郑州大学2004年硕士论文 大鼠骨髓间质干细胞在心肌梗死及心力衰竭中应用的实验研究 浮细胞存在，换液后，见扁圆形贴壁生长的细胞，散在分布