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实验六 侧孢芽胞杆菌菌种活化及复壮 一、实验目的 1.了解菌种衰退的原理． 2.熟悉发酵菌种活化和复壮的方法． 二、实验原理 菌种在传代过程中，原有的生产性状会逐渐下降，这就是菌种的衰退。衰退是菌株的自发突变引起的，一旦发现衰退，就必须进行复壮。复壮就是通过纯种分离和性能测定等方法从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌种原有性状的一种措施。菌种活化就是逐级扩大培养是为了得到纯而壮的培养物，即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。菌种发酵有一般需要2-3代的复壮过程，因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同，所以要活化,让菌种逐渐适应培养环境实验1 实验目的 了解菌种保藏的基本原理。掌握几种常用的菌种保藏方法。 2原理 菌种是一种重要的生物资源菌种保藏的方法很多。其原理却大同小异，不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境，即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。依据不同的菌种或不同的需求，应该选用不同的保藏方法。斜面保藏、半固体穿刺、石蜡油封存和沙土管保藏法较为常用，也比较容易操作。 3材料 3.1菌株 待保藏的适龄菌株斜面。 3.2培养基 肉汤蛋白胨斜面、半固体及液体培养基。 3.3试剂 10%HCl、无水氯化钙、石蜡油、五氧化二磷。 3.4器具及其他用品 用于菌种保藏的小试管（10mm×100mm）数支、5mL无菌吸管、1mL无菌吸管、灭菌锅、真空泵、干燥器、冰箱、无菌水、筛子（40目、120目，孔径/mm= ）、标签、接种针、接种环、棉花、牛角匙等等。 沙土管保藏步骤 4.1流程 制沙土管→灭菌→制菌液→加样→干燥→保藏 4.2步骤 （1）制作沙土管?选取过40目筛的黄沙，酸洗，再水洗至中性，烘干备用，过120目筛子的黄土备用；按1份土加4份沙的比例均匀混合后，装入小试管，装量1cm左右。 （2）灭菌?加压汽灭菌，直至检测无菌为止。 （3）制备菌液?取3mL无菌水至待保藏的菌种斜面中，用接种环轻轻刮下菌苔。振荡制成菌悬液。 （4）加样?用1mL吸管吸取上述悬液0.1mL至沙土管，再用接种环拌匀。 （5）干燥?把装好菌液的沙土管放入干燥器或同时用真空泵连续抽气，使之干燥。 （6）保藏?干燥后的沙土管可直接放入冰箱中保藏；也可以用石蜡封住棉花塞后放冰箱中保藏。 思考题 （1）？ （）沙土管法适合保藏哪一类微生物？ 一、实验目的 1、掌握发酵培养基配制的原则 2、熟悉优化发酵培养基的方法：正交试验、均匀化设计、响应面法、二次正交旋转法。主要选用正交试验，也可用其他方法。 二、实验原理 发酵培养基是指大生产时所用的培养基，由于发酵产物中一般含有较高比例的碳元素，因此培养基中的碳的含量也应该比种子培养基中高，如果产物的含氮量高，还应增加培养基中的氮源比例。但必须注意培养基中的渗透压，如果渗透压太高，又会反过来抑制微生物的生长，在这种情况下可采用流加的方法逐步加入碳氮源。 培养基组分对发酵起着关鍵性的影响作用。工业发酵培养基与菌种筛选时所用的培养基不同，一般以经济节约为主要原则，因此常用廉价的农副产品为原料。选择碳源时常用山芋粉、麸皮、玉米粉等代替淀粉，而用黄豆粉、豆饼粉等作为氮源；此外，还应考虑所选原料不至于影响下游的分离提取工作。由于这些天然原料的组分复杂，不同批次的原料成分各不相同，在进行发酵前必须进行培养基的优化试验。 三、实验器材与试剂 1、菌种：侧孢芽胞杆菌斜面菌种 2、种子培养基：蔗糖1.5%、蛋白胨0.2%、酵母膏0.4%、碳酸钙0.5%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸镁0.03%、硫酸锰0.002% 3、发酵培养基：参考种子培养基进行研究 4、计数用平板：牛肉膏蛋白胨培养基 5、实验器材：天平、手提式电热灭菌锅、超净工作台、接种环、电热鼓风干燥箱、温控摇床、光学显微镜、电炉、酒精灯、玻璃漏斗、试管、三角瓶、载玻片 四、实验步骤（正交试验） 1、确定因素和水平：选蔗糖、蛋白胨、酵母膏作为主要因素 2、选用合适的正交表：三因素四水平表（附三因素四水平正交表） 3、表头设计：不考虑交互作用，可随机排列 4、列出试验方案 5、进行试验：培养条件180r/min，37℃.镜检80%的菌体形成芽胞，结束培养。 6、正交试验结果的统计分析 五、注意事项 1、有条件需进行单因子试验 2、培养温度、摇床转速、菌种及接种量等结果影响较大，需保持条件一致。 六、思考题 1、比较各种优化方法特点？ 2、如果不用正交实验，四因素三水平的实验总共需要做几组？ 发酵培养基优化用四因素三水平正交试验表 组别 因素A 因素B 因素C 因素D 菌数 1 1 1 1 1 2 1 2 2 2 3 1 3 3 3 4 2 1 2 3 5 2 2 3 1 6 2 3