重组质粒的连接转化及筛选.pdfVIP

中国试剂网 3.13.11.20 重组质粒的连接、转化及筛选 第一节 概 述 质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA 片段(＜10kb) 且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说 是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒 DNA 和目的 DNA 片段, 然后体外使两 者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中, 如何区分 插入有外源 DNA 的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通 过调整连接反应中外源 DNA 片段和载体 DNA 的浓度比例,可以将载体的自身环 化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化 等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来 鉴别重组子和非重组子。 外源 DNA 片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种： 1、带有非互补突出端的片段 用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生 带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的 DNA 片段，一般情况下,常