蛋白质与生物大分子相互作用及研究.ppt

蛋白质与生物大分子的相互作用研究 张雪梅 apoe@163.com 检验医学院 基因的功能研究成为热点，研究的对象即为基因编码的产物—蛋白质，生物功能的主要体现者和执行者。 在所有生命活动中，细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性，这其中必须涉及蛋白与蛋白、核酸的相互作用。 掌握或发明研究相互 作用的方法非常重要。 主要内容 免疫共沉淀(Co-IP)：蛋白—蛋白，蛋白—DNA Pulldown（亲和层析）：蛋白—蛋白，蛋白—DNA/RNA 电泳迁移实验(EMSA)：蛋白—DNA/RNA 酵母双杂交系统：蛋白—（X）—蛋白 实验注意事项 细胞裂解采用温和的裂解条件（NP40、Triton-X100等）；每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验摸索确定。 确保共沉淀的蛋白是由所加入的特异性抗体沉淀得到的，而并非其他非特异蛋白： 1、使用单克隆抗体：多抗？ 2、使用对照样本或抗体（同型抗体） Structural basis of G protein–coupled receptor–G protein interactions。Nature Chem Biol, 2010, 6: 541-548（分析蛋白相互作用的位点） 将不同变异体的表达质粒共转染入cos-7细胞中，单独转染的为对照；左图为IP前的IB,右图为IP后的IB，二者复合物为80kD（阳性结果）。图为两次独立实验的其中一次。 TAK-242 (Resatorvid), a Small Molecule Inhibitor of Toll-Like Receptor (TLR) 4 Signaling,Binds Selectively to TLR4 and Interferes with Interactions between TLR4 and Its Adaptor Molecules. Mol Pharmacol, 2011,79:34-41（鉴定） Screening of ClpE interaction proteins Construct recombinant plasmid pAE03-ClpE and transform into S. pneumoniae D39 Western blot for identification Co-Immunoprecipitation (Co-IP) transfer 1ml（OD600=0.5-0.6）cleared lysate of D39 and D39-ClpE-GFP to a 10ml beaker separately. Add 500μl protein G-agarose beads (GE) , incubate for 3h at 4℃ on a rotating apparatus with magnetic stirrer to remove non-specifically bound proteins. Add 800μl protein G-agarose beads and 20–25μg GFP antibody (Clontech) to the supernatant. Incubate overnight at 4℃ on a rotating apparatus. Wash beads five times with 1 ml PBS for 2 min each wash. Resuspend pellet in 50-80μl 2× SDS sample buffer. Load 10–15 μl of supernatant on an SDS/polyacrylamide gel. 优点： 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态； 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响。 难点： 需要高质量的抗体进行IP； 两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用； 检测不到弱或瞬时的相互作用。 Genome-Wide Mapping of in Vivo Protein-DNA Interactions. Science, 2007, 316(5830): 1497-1502 获得的经典与非经典的神经限制性沉默元件(NRSE)序列。 高质量的ChIP-seq结果提供了研究新的DNA-蛋白相互作用的内容，发现其为胰岛发育调控网络中的重要转录因子。 Ago1 Interacts with RNA Polymerase