核酸的实验.pptVIP

核酸大实验 实验1 动物肝细胞内DNA和RNA 的提取和分离 实验目的 初步掌握从组织中分离和提纯DNA与RNA的原理和方法。 实验原理 细胞中核酸以DNP，RNP形式存在，而DNP,RNP在不同浓度的氯化钠溶液中溶解度不同。DNP在0.14mol/L NaCl中溶解度最低，而RNP却易溶解，故用0.14mol/L NaCl洗涤组织匀浆，可得到DNP，再用SDS、氯仿-异戊醇除蛋白，乙醇沉淀后即可得到DNA。 RNA的分离提纯目前多用酚仿抽提法。组织匀浆在苯酚与氯仿存在下，RNA与变性蛋白质分离。酚使蛋白质变性凝固，RNA溶解在水相中，用乙醇使RNA从水相中沉淀而达到分离。 分离核酸?提纯核酸（SDS，苯酚，氯仿）?乙醇沉淀?测定 仪器与试剂 仪器: 研钵、离心机、 天平、玻璃棒、恒温水浴锅、25ml容量瓶、50ml容量瓶及实验常用器皿 （约11个离心管） 试剂: 0.14mol/L氯化钠 -0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液(含1mmol/L EDTA)、10%氯化钠溶液、氯仿-异戊醇溶液（24:1）、20% 十二烷基硫酸钠（SDS）、95%乙醇（预冷）、苯酚-氯仿-异戊醇醇溶液（25:24:1)、 0.1mol/L 氢氧化钠溶液 实验操作 (一) DNP与RNP的分离 1、 取新鲜肝脏，用表面皿称取0.5g，用0.14mol/L氯化钠 -0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液（含1mmol/L EDTA）冲洗除去血水。洗净后立即将肝脏置于冰浴研钵中，边滴加缓冲液边研磨(加入2ml），至匀浆状，转移至离心管中，每次用0.5ml缓冲液冲洗研钵至离心管，3次。（研磨时间不要超过30min） 2、 匀浆液于3000r/min 离心15min，上清液中即含RNP ，沉淀中含DNP。 3、将上清液倒入另一支离心管。再往上述沉淀中加入3.5ml缓冲溶液，同样离心15min，取上清液倒入另一离心管。向DNP沉淀加入3ml 10%氯化钠溶液，摇匀，置于冰箱内，使DNP充分溶解，留至下午用。 （二） RNA的提取 1、各向两支RNA上清液离心管加入与清液等体积的酚仿醇溶液（25：24：1），剧烈震荡10min，平衡后3000 r/min离心15min。重复操作，直到离心后两相之间无明显变性蛋白为止。（一般重复一次即可） 2、再取两支离心管各加入约上层水相2.5倍体积的预冷95%乙醇，将两支管的水相对应滴入，摇匀，置于冰箱内静置20min， 3000r/min 15min离心，后用蒸馏水多次润洗沉淀至烧杯，并定容至50ml. （三）DNA的提取 1、下午，从冰箱取出DNP样液，加入约2ml氯仿-异戊醇溶液（24:1）和 0.5ml 20% SDS，上下振荡10min（注意不要过于剧烈），于3000r/min离心15min，吸取上面含DNA和DNP的水层至另一离心管，弃去中间蛋白层和下层液体。 3、再次向取出的上层水相加入约1/2体积 氯仿-异戊醇溶液，振荡，离心，继续抽提， 直到离心后两相之间无明显变性蛋白为止。 （一般重复一次即可） 4、取两支离心管各加入约与离心后上层水 相等体积的预冷95%乙醇，将水相分两等份 滴入，边滴边搅拌，后于冰箱内静置20min，挑出絮状DNA至烧杯，再将溶液3000r/min15min离心，倒去乙醇，用氢氧化钠多次润洗沉淀至上述烧杯，溶解完全后定容至25ml. 实验2 地衣酚法测定RNA含量 实验目的 掌握用地衣酚法测定RNA含量的原理和方法。 实验原理 核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糖醛，后者与地衣酚（即3，5—二羟基甲苯，或苔黑酚）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂，反应产物在670nm处有最大吸收，RNA浓度在20~250ug/ml范围内，光密度与RNA浓度成正比。地衣酚反应特异性差，凡是戊糖均有此反应。样品中少量DNA存在对测定无干扰，蛋白质、粘多糖在含量高时会干扰测定。 仪器和试剂 1、仪器： 可见分光光度计、移液管、恒温水浴锅 2、试剂： （1） 100ug/mL标准RNA溶液：称取10mg纯RNA用少量水溶解(若不溶可用0.1mol／L NaOH溶液溶解，后加等量0.1mol／L HCL溶液调至pH7.0)，定容至100mL。 （2） 地衣酚试剂：取0.1gFeCl3·6H2O溶于100mL浓HCl配制成0.1%三氯化铁浓盐酸溶液。使用前再用上述溶液为溶剂加