昆虫线粒体基因组及研究方法.pptVIP

昆虫线粒体基因组研究方法 一. 昆虫线粒体基因组的研究意义 （一） 适合做进化生物学研究。被广泛用于研究基因组结构和功能、群体遗传结构，谱系地理学和各种分类学水平上的系统发育关系研究。 （二）功能基因的研究 二. 研究方法 （一）获取待研究昆虫的线粒体基因组 （二）对线粒体基因组结构进行分析 （三）与其他昆虫线粒体基因组进行比对 （四）进行系统发育分析 具体步骤 1. 采集标本并冷冻 2. 提取DNA 3. 扩增线粒体基因组上的经典片段 4. 设计引物，扩增其他片段 5. 将所有片段拼接成完整的线粒体组（环形） 6. 校对数据，利用软件、比对等方法，标出tRNA、16S、12S及13个蛋白质基因的位置，上传线粒体基因组数据至Genbank。 7. 对tRNA进行结构预测 8. 对12S及16S进行结构预测 9. 对该昆虫线粒体基因组上特殊位置进行讨论 10. 系统发育分析 1. 采集标本及冷冻 利用高压汞灯及黑光灯诱集，然后将标本低温冷冻致死，取一侧后足泡入无水乙醇，置于-20度冰箱保存，供提取DNA。标本展翅并保存，以待进一步形态鉴定。 2. DNA提取 总DNA提取试剂盒为德国默克公司QIAGEN DNeasy Tissue kit。PCR试剂使用TIANGEN天根生化科技有限公司生产的PCR MasterMix。 将浸泡于无水乙醇中的足取出，晾干，分成2-3段，放在1.5ul的离心管中。按照QIAGEN DNeasy Tissue kit使用手册的说明进行总DNA提取。抽提的DNA溶于200-300ul的AE缓冲液，并置于在-20℃冰箱保存备用。 3. PCR扩增和测序 先扩增线粒体基因组上的经典片段，如COⅠ、COⅡ、COⅢ、Cob等。 例：扩增COI基因片段　　　 扩增引物为通用引物LCOI490（5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’）和HCO2198（5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’）（Folmer et al , 1994）。反应体系为25μl，其中上下游引物各0.5μl，PCR MasterMix 12.5μl ，DNA模板3μl，ddH2O 8.5μl。扩增反应条件：预变性94 ℃ 2分钟，变性94℃ 1分钟，退火50 ℃ 1分钟，延伸72 ℃ 1分钟, 进行35个循环。取3μl PCR扩增产物使用1%的琼脂糖胶电泳检验。PCR产物测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。 4. 设计引物，扩增其他片段 利用软件Primer5.0 设计引物，扩增其他片段。最难扩增的片段是控制区（A+T-rich）。因为引物很难设计，所以需要花费一些时间及精力。 5. 将所有片段拼接成完整的线粒体组（环形） 利用软件DNAstar对扩增好的各个片段进行拼接。用Bioedit软件查看测序原始峰图，校对各个碱基。将校对好的数据上传至Genbank。获取Genbank的accession number。 6. 寻找tRNA及预测tRNA结构 用tRNAscan-SE Search Server 在线软件，寻找tRNA，一次可找出17-19个。其余与其他昆虫线粒体进行比对找出。 用DNAsis预测tRNA结构，对于较为特殊的tRNASer(AGN)，需手工画出。 7. 预测12S及16S结构 用软件XRNA进行预测。预测不到的，用手工画出。 8. 对特殊结构进行分析讨论 例：控制区的结构分析 在线软件 Mfold Web Server (Zuker, 2003; /?q =mfold) 9. 系统发育分析 用软件MEGA5.0，RAxML,Paup4.0,mrbayes等软件进行分析 本文观看结束！！！ * * 谢 谢 欣 赏！ *