三蛋白质含量测定.docVIP

实验三 奶粉中蛋白质含量的测定 1、掌握样品处理方法 2、掌握凯氏定氮法 2.1 蛋白质含量测定 蛋白质是生命的物质基础，是人体重要的营养物质，因而也是食品中重要的营养指标。测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值，合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极其重要的意义。 测定蛋白质最常用的方法为凯氏定氮法。此法是通过测定出样品中的总氮含量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质含量的。经过人们长期的应用和不断改进，凯氏定氮法已演变成常量法、微量法、半微量法、改良凯氏法及自动定氮法等，具有应用范围广、灵敏度高、回收率好及不需要昂贵仪器等优点。但凯氏定氮法操作较费时（除自动凯氏定氮法外），单消化过程一般系要2~3h，如果遇到高脂肪、高蛋白样品消化需要5h以上；而且，在操作过程中会产生大量有害气体。因此，为了满足生产单位对工艺过程快速控制分析，减少环境污染和操作简便省时，后来再凯氏定氮法的基础上又陆续出现了水杨酸比色法、双缩脲法、福林-酚比色法、染料结合法、紫外分光光度法、折光法旋光法及近红外线光谱法等蛋白质快速测定法。本节重点介绍凯氏定氮法和水杨酸比色法两种方法，要求掌握这两种方法的测定原理和操作技术。 2.1.1 凯氏常量定氮法 （1）原理 样品与硫酸和催化剂一同加热后消化，使蛋白质分解，其中的碳和氢分别被氧化成二氧化碳和水逸出，而有机氮转化成氨后与硫酸结合生产硫酸铵，然后在碱性条件下蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再用硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即得蛋白质含量。以甘氨酸为例，该过程的反应方程式如下。 消化：NH2CH2COOH+3H2SO4 2CO3+3SO2+4H2O+NH3 2NH3+H2SO4 (NH4)2SO4 蒸馏：（NH4）2SO4+2NAOH 2H2O+NA2SO4+2NH3 吸收：NH3+4H3BO4 NH4HB4O7+5H2O 滴定：NH4HB4O7+HCL+5H2O NH4CL+4H3BO3 在消化过程中，为了加速蛋白质分解，缩短消化时间，常加入硫酸钾、硫酸铜等物质。加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物分解，因为它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度。但其加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解放出氨而造成损失。硫酸铜除起催化作用外，还可作消化终点和下一步蒸馏时碱性反应的指示剂。 （2）适用范围 凯氏定氮法适用于各类食品中的蛋白质测定，最低检出量为0.05mg氮，相当于0.3mg蛋白质。由于样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，故本法测出的结果为粗蛋白质含量。 （3）药品 1浓硫酸 2硫酸铜 3硫酸钾 4 40%氢氧化钠溶液 5 4%硼酸吸收液：称取20g硼酸溶解于500ml热水中，摇匀备用。 6甲基红-溴甲酚绿混合指示剂：5份0.2%溴甲酚绿95%乙醇溶液与1份0.2%甲基红乙醇溶液混合均匀。 7 0.1mol/L盐酸标准溶液 （4）主要仪器 1 500ml凯氏烧瓶， 2定氮蒸馏装置 （5）操作方法 1样品处理 ：准确称取固体样品0.2~2或半固体样品2~5g，或吸取液体样品10~20ml，小心移入干燥洁净的500ml凯氏烧瓶中，然后加入研细的硫酸铜0.5g、硫酸钾10g和浓硫酸20ml，轻轻摇匀后，加大火力，保持瓶内液体微沸，至液体至蓝绿色且澄清透明后，再继续极热30min。冷却，小心加入200ml蒸馏水，待冷却后，加入数粒玻璃珠以防蒸馏时暴沸。 2碱化蒸馏：将凯氏瓶 按图蒸馏装置方式连接好，塞紧瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶液面下，吸收瓶内预先装入了50ml%4硼酸溶液及混合只指示剂2~3滴。放松小漏斗处的夹子，通过漏斗徐徐加入70~80ml40%氢氧化钠溶液，当漏斗中尚有少量氢氧化钠溶液时，夹紧夹子，在漏斗中加入约5ml的蒸馏水，松开夹子使水流入烧瓶中，注意留少量水在漏斗中作水封，夹紧夹子。加热蒸馏，至氨全部蒸出（馏液约250ml），将冷凝管下端提离液面，用蒸馏水冲洗管口，继续蒸馏1min，用表面皿接几滴馏出液，以奈氏试纸检查，如无红棕色物生成，表示蒸馏完毕，即可停止加热。 3滴定：将上述吸收液0.1mol/L盐酸标准溶液滴定至由蓝色变为微红色即为终点，记录盐酸溶液用量。同时做一空白试验（除不加样品外，从消化开始操作完全相同），记录空白实验消耗标准盐酸溶液体积。 （6）计算 蛋白质含量=【Cx（V1—V0）x M氮 / m x 1000】 x F x100% 式中：c为盐酸标准溶液的浓度，mol/L：V1为滴定样品吸收液时消耗盐酸标准溶液体积，ml：V0为滴定空白吸收液时消耗盐