WB蛋白印迹在生物化学这一块是常规实验,就像有人说炒菜 ….docVIP

WB试验每步原理和技术及试剂的分析生物通生物通Alexa Fluor的抗体标记试剂盒生物通这里 DAB 4-CN AEC TMB 学名 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride 4-chloro-1-naphthol 3-amino-9-ethyl carbazol 3,3,5,5tetramethylbenzidine 分子量 214.14 178.58 210.28 240.4 稳定性 好 一般 避光 好 灵敏度 250pg 1ng ? 100pg 背景 一般 低 ? 高 终产物成像性 不能很好的成像 容易成像 ? 容易成像 颜色 褐色 介于蓝色与蓝紫色之间 （可用于double-staining） 棕红色 蓝紫色 毒性 有（疑有治癌作用） 无 有 无 ?最熟悉的底物应该是33二氨基联苯胺DAB，DAB可以和HRP作用形成褐色不溶性产物，灵敏度高，特异性好，缺点就是需要现配现用，显色后光照数小时会褪色，不能永久保存，需要拍照记录，而且有毒。DAB的选择有一点小小的技巧——33二氨基联苯胺4盐酸盐的纯品分子量为360.1，通常是深棕色粉末，不太好溶于水，容易得到有色颗粒的溶液而导致膜上的背景，而且价格还被炒得贵；但是如果选择2水合33二氨基联苯胺4盐酸盐（分子量396.14）就是白色粉末状晶体，易溶，溶液无色均匀，量大价格还便宜。DAB还有溶剂形式的，便于使用。由于DAB显色是褐色，不如4-CN反差大容易拍照，有的厂家还推出了DAB+4-CN混合底物，结合了DAB灵敏度高和4-CN背景低，易成像的优点，能获得很好的黑色沉淀成像。用金属离子增强信号的DBA显色试剂灵敏度可以高达20pg。TMB的signal-to-noise信噪比高，成分安全，特别合适于灵敏度要求高的WB，但是也要避免由于灵敏度高而引起的高背景，因此可以相应的延长封闭的时间和注意洗涤的次数；ACE各方面性质与DAB相似，但灵敏度要比DAB差一点。 ?HRP化学发光反应底物经过多个著名厂家的不断研究开发而有了更显著的改进。Luminol是经典的HRP化学发光底物。化学发光底物主要考虑的是：发光信号强弱——发光信号当然越强越好，强发光信号持续的时间——也是越长越好，还有就是背景低灵敏度高。化学发光法由于仅在酶和底物都存在的时候才会发光，不同于生色反应般形成不溶的产物于膜上累积，所以特别适合同一张膜对不同的目标蛋白分别进行多次检测。目前最高检测灵敏度已经达到低飞克（Femto）级别而成为安全且灵敏度最高的WB检测方法。随着Cooled-CCD技术的发展，成像系统成本越来越低，因而在现在的实验室里这些设备越来越普遍。Cooled-CCD照相机与X胶片相比具有瞬时影像处理、立即输出、不需要胶片处理装置及暗室等成本花费、可用软件半定量分析等优点，然而，这项技术应用于WB化学发光法显影还要求底物能产生高强度、长持续时间的信号，以被照相机捕获到。经过各大厂家的不断开发，现在的化学发光检测试剂从以前的发光时间持续几十分钟，到现在多数试剂可持续长达几个小时到一天，新的化学发光检测试剂盒很多兼容CCD成像检测，如果是实验室有CCD成像设备的不妨留意试剂盒是否有这种说明。发光时间的延长即使对于X底片的用户也是好消息——因为压片显影后如果发现压片结果不理想，还可以多次重复压片而不需要重新反应。 化学发光的常见问题主要是抗体浓度过高——所以抗体用量要比规定的稀释倍数放大许多，确保HRP不会过量导致底物过快消耗完而引起结果不稳定。 ?GE Healthcare（原安玛西亚）的ECL堪称是经典，ECL在许多研究人员心目中的几乎成为化学发光法的代名词，有时竟然是高品质文章的保证之一，可见其经典。后来推出的ECL Plus和ECL Advance不单将检测灵敏度提高了10—20倍，发光时间也长达24小时以上，兼容CCD成像系统的检测，使得ECL系统继续领导潮流。前不久GE Healthcare公司在生物通 ECL Advance ECL ECL Plus Recommended applications Highest sensitivity Western blotting primary antibody and/or target is very low abundance Routine Western blotting High sensitivity Western blotting and chemifluorescent detection on scanners Sensitivity Up to 10 times grea