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Western Blot常见问题解析 1.电泳中的问题 出现问题 原 因 ︶条带呈笑脸状 l凝胶不均匀冷却，中间冷却不好;电泳系统温度偏高 ︵条带呈皱眉状 l可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全 拖尾 l样品溶解不好 纹理（纵向条纹） l样品中含有不溶性颗粒 条带偏斜 l电极不平衡或者加样位置偏斜 条带两边扩散 l加样量过多 2. Western blot结果中背景高且不均匀 可能的原因 建 议 抗体浓度太高 l一抗或二抗浓度太高会导致高背景，降低抗体浓度 使用的封闭液不兼容 l对比不同的封闭缓冲液 非特异性位点封闭不足 l优化封闭缓冲液，最好的封闭缓冲液具有系统依赖性 l提高封闭液中蛋白的浓度 l优化封闭时间和/或温度。室温封闭至少1 h或者4°C封闭过夜 l在封闭液中加入Tween-20，Tween-20的终浓度为0.05% 封闭液中与其它蛋白发生抗体的交叉反应 l换一种不同的封闭液 l不要用含抗生素蛋白的牛奶封闭，牛奶含生物素 l交叉反应的检测。封闭一张干净的膜，与抗体一起孵育，然后用超感应化学发光底物检测 洗涤不充分，增加洗涤次数和使用缓冲液的体积 l降低HRP结合物的浓度 l如果洗涤液中无Tween-20，添加Tween-20使其终浓度为0.05% 膜的曝光时间过久 l缩短印迹膜曝光到胶片的时间 l按照说明书的指示，保证膜始终是湿润的 l用一张新膜 l保证膜完全被液体覆盖，避免其干燥 l在孵育过程中始终进行震荡 l小心夹膜——损坏膜可能导致非特异性结合 l不能空手持膜，始终带干净手套或用镊子 缓冲液污染或结块沉淀 l制备新的缓冲液 抗体浓度太高 l若一抗和/或二抗浓度过高会产生高背景，降低抗体浓度 HRP处产生聚集体 l用0.2 μm过滤器过滤结合物 结合可产生斑点 l用一种新的高质量的结合物 缓冲液中有污染 l使用新的缓冲液 l缓冲液使用前过滤 操作设备被污染 l保证电泳仪器、印迹仪器和孵育用容器清洁，无外缘污染物 l保证在转膜后没有凝胶留在膜上，蛋白可能黏在胶上导致背景 3. Western blot结果中信号弱或无信号 可能的原因 建 议 蛋白未转到膜上 l转膜结束后，用总蛋白染色剂染胶来确定转膜效率。（注：总蛋白染色剂可能检测不到低量的抗原。） l确保转膜过程中胶与膜完全接触。 l确保转印夹层排布正确 l确保按照膜的制造商的使用说明润湿膜 l确保转印部件在电印迹过程中未过热 l使用正对照和/或分子量Marker l优化转印时间和电流 l确保样品制备条件优于蛋白印迹，为破坏样品的抗原性。（注意：许多蛋白不能在还原状态下进行） 蛋白未完全结合到膜上 l在转膜缓冲液中加入20%的甲醇促进结合。低分子量的抗原可能会穿过转印膜，需使用小孔径的膜进行。 抗体不足 l增加抗体浓度。抗体与目标蛋白的亲和力可能很小 l抗体可能失活，可用斑点印迹检测其活性。 抗体浓度太高 l使用太多一抗或二抗可能导致信号迅速消失，呈现出很弱的信号。 抗原不足 l加入更多的蛋白进行跑胶 l抗原被封闭液掩蔽 l试用不同的封闭液 l优化封闭液中蛋白浓度 缓冲液中含有叠氮钠 l叠氮钠是一种HRP的抑制剂，缓冲液不能使用叠氮钠作为防腐剂 曝光时间太短 l延长胶片的曝光时间（注意：超感应化学发光底物会持续发光至少6个小时） 底物孵育时间太短 l在使用超感应底物时需进行5分钟的底物孵育。 底物失活 l超感应化学发光底物和超感应west膜室温状态下化学底物可保存至少12个月，超感应免疫膜化学发光底物可保存至少6个月 l为衡量底物的活性，准备一个小量的工作液在一个暗室内，加入少量的HRP结合物，会观察到绿光。如果未检测到光，底物或HRP结合物均有可能失活 l确保两底物无交叉污染两种底物试剂的污染可能导致活性下降 膜可以修复剥离重新用探针检测 l在膜剥离过程中可能会有抗原损失或变性 l优化剥离程序 l如有必要可重新用探针检测 l避免在同一张膜上重复进行探针检测 在膜上消解抗原 l封闭底物可能含有蛋白水解酶活性（如明胶） 印迹膜保存时蛋白降解 l准备一张新的印迹膜 4. Western blot结果中背景较高 可能的原因 建 议 膜封闭不够 l延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液 一抗稀释度不适宜 l对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度 一抗孵育的温度偏高 l建议4℃结合过夜 选择的膜容易产生高背景 l一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF膜低 膜在实验过程中干过 l实验过程中要注意保持膜的湿润 检测时曝光时间过长 l减少曝光时间 5. Western blot结果中杂带较多 可能的原因 建 议 目的蛋白有多