伤寒沙门菌质粒对巨噬细胞THP-1自噬、凋亡和炎症反应的影响.pdf

伤寒沙门菌质粒对巨噬细胞THP-1 自噬、凋亡和炎症反应的影响 中文摘要 中文摘要 目的：通过建立伤寒沙门菌 （Salmonella enterica serovar Typhi，S.typhi ）感染 的细胞模型，用自噬阻断剂氯喹 （chloroquine ，CQ ）和Beclin 1 过表达技术，研 究伤寒沙门菌质粒pRST98 对人巨噬细胞THP-1 自噬、凋亡和炎症反应的影响，为 进一步阐明该质粒增强宿主菌毒力的分子机制提供理论和实验依据。 方法： 一、伤寒沙门菌质粒对巨噬细胞THP-1 自噬过程的影响 1. CQ 对THP-1 细胞自噬阻断浓度的确定 CQ 是一种治疗疟疾的药物，近年来被广泛用作自噬阻断剂，它通过提高溶酶 体的pH 值使酸性水解酶失活，导致自噬溶酶体无法分解底物，造成自噬相关蛋白 的累积。本实验以0、10、20 、30、40 、50、60、70 和80 μM CQ 的培养液作用 THP-1 细胞6 h，用蛋白质印迹技术 （western blot ，WB ）检测自噬底物蛋白p62 的累积水平；作用细胞24 h 后，用噻唑蓝还原法 （methyl thiazolyl tetrazolium， MTT ）检测细胞存活率。 2. CQ 对受试菌的影响 用上述方法测定的CQ 适宜浓度作用受试菌24 h，OD600 测定菌液浓度，检测 该浓度CQ 对细菌的影响。 3. CQ 对THP-1 细胞感染模型自噬的影响 由于伤寒沙门菌只感染人类的严格宿主特异性，本实验以携带伤寒沙门菌质 粒pRST98 的野生株ST8、消除pRST98 的突变株ST8-ΔpRST98 和将pRST98 经接合转移 重新导入的回补株ST8-c-pRST98 为受试菌，分别与人巨噬细胞 THP-1 共培养建立 感染模型。用对数生长期细菌按感染复数 （multiplicity of infection ，MOI ）50:1 感 染细胞，同时设立自噬阻断剂CQ 干预组。将细菌与细胞共作用1 h 后吸取上清， 加入含100 µg/ml 的阿米卡星 （amikacin，AMK ）培养液作用2 h 以去除胞外菌， 将AMK 浓度降为 10 µg/ml 以抑制从感染细胞中释放至培养液中的细菌生长。分 别在感染的1 h 和3 h 收获细胞：①WB 检测细胞自噬标志蛋白——微管相关蛋白 I 中文摘要 伤寒沙门菌质粒对巨噬细胞THP-1 自噬、凋亡和炎症反应的影响 1 轻链3-II （microtubule-associated protein 1 light chain 3-II ，MAP1-LC3-II ）及自噬 底物蛋白p62 表达；② 将带有红色和绿色荧光的mRFP-GFP-LC3 质粒转染THP-1 细胞后，用共聚焦激光扫描显微镜 （confocal laser scanning microscope ，CLSM ） 观察细胞自噬体及自噬溶酶体的变化。 二、伤寒沙门菌质粒对巨噬细胞THP-1 凋亡和炎症反应的影响 beclin 1 基因是第一个被确认的哺乳动物自噬调控基因，其编码产物Beclin 1 是自噬发生的标志蛋白。本部分实验用脂质体转染法将外源性 beclin 1 基因导入 THP-1 细胞，研究Beclin l 蛋白过表达后伤寒沙门菌质粒对巨噬细胞凋亡及炎症反 应的影响。感染模型建立同第一部分，分别设野生株ST8、突变株ST8-ΔpRST98 和 回补株ST8-c-pRST98 感染的Beclin 1 过表达组及对照组，共6 组。在感染后1 h、 3 h、5 h、9 h 和13 h 收获细胞：① WB 检测质粒转染后Beclin 1 表达效率；② Annexin.V-FITC/Propidium Iodide （Ann.V/PI ）双染流式细胞术（flow cytometry， FCM ）分析细胞凋亡率；③ 酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay， ELISA ）检