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结核分枝杆菌WecA膜蛋白的表达和功能分析 硕士生姓名： 徐立铭 指导教师： 马郁芳教授 指导小组： 辛毅教授 专业名称： 生物化学与分子生物学 摘 要 tuberculosis)是结核病的病原体，全世界大 结核分枝杆菌(Mycobacterium 约有1／3入口感染或携带这种杆菌。从上世纪末开始，由于耐多药甚至广泛耐药 结核分枝杆菌的出现使已经得到控制的结核病发病率又呈现逐年上升趋势。因 此，寻找新的抗结核药物的靶点是当前结核病研究的主要任务之一。 结核分枝杆菌细胞壁具有独特的结构，对于维持细胞的生存和繁殖有非常 重要的作用。其细胞壁的核心结构由三种大分子组成，由外至内分别为分枝菌酸、 聚阿拉伯半乳糖和肽聚糖。其中聚阿拉伯半乳糖与肽聚糖之间是通过L．鼠李糖 N -D-N．乙酰葡糖胺(L．rhanmose…DGleNAe)衔接双糖共价连接起来的，这个衔 接双糖对于维持结核分枝杆菌细胞壁的完整性有极其重要的作用。 L．鼠李糖．D-N．乙酰葡糖胺衔接双糖合成的第一步反应是将糖基供体 PGIcNAc，此反 团转移到脂类载体C50—P(Deeaprenylphosphaye)上形成C50…P 应由N．乙酰葡糖胺．1．磷酸转移酶催化完成。N．乙酰葡糖胺．1．磷酸转移酶对于衔 接双糖的合成有至关重要的作用，一旦该酶被抑制或缺失，衔接双糖将不能合成。 在大肠杆菌中wecA基因编码的N．乙酰葡糖胺．1．磷酸转移酶(WecA)参与 脂多糖(LPS)中O．抗原多糖的合成。本实验室通过对大肠杆菌wecA基因敲除 的编码基因wecA；并构建了耻垢分枝杆菌wecA基因敲除菌株，通过测定其生长 曲线和使用电镜观察其形态学和细胞结构变化，证明了wecA是分枝杆菌生长必 需基因。由此可见，WeeA是研发抗结核药物的一个非常好的潜在靶点。 通过对结核分枝杆菌WecA的结构预测，WeeA是一个具有11个跨膜结构 域的膜蛋白。由于其结构的复杂性，难于在Ecoli宿主细胞中获得高表达的WeeA 膜蛋白，也不便对WecA膜蛋白进行纯化。 目的： wecA表达载体在EcoliER2566菌株中表达WecA膜蛋白 1．用pETl6b-Tb 并进行纯化；2．建立WecA酶活性分析方法，分别使用薄层层析(TLC)和高 coli wecA表达载体，在EMV501菌株中低温 的其它方法，包括构建pCold．Tb wecA 诱导WecA膜蛋白的表达；获取删除5’端的wecA基因，构建pET29b-Tb wecA del2表达载体，在多种大肠杆菌表达菌株中表达N末端 dell和pET29b．Tb Protein 截短的WecA膜蛋白；使用MembraneMaxKit在体外表达 Expression WecA膜蛋白。 结果： coli wecA表达载体在EER2566菌株中表达WecA膜蛋白 1．用pETl6b-Tb 并纯化出WecA膜蛋白 6b-Tb 在25℃条件下用终浓度l wecA／ER2566生长 mM的IPTG诱导p