兔波氏杆菌和巴氏杆菌LAMP快速诊断技术的研究.pdfVIP

DissertationforMaster IYllllY DETECTIONOF 0FARAPIDMETHODFOR STUDY AND BRONCHISEPTICA RABBITBORDETELLA LAMP MULTOCIDABY PASTEURELLA Ke Candidate：LI Guo—lian Supervisor：BAO Discipline：Zoologe of Science． ChemistryLife College Normal 321004 Zhejiang University,Jinhua 2013 April 兔波氏杆菌和巴氏杆菌LAMP快速诊断技术研究 摘要 兔波氏杆菌(Bordetella multocida， bronchiseptica，Bb)和巴氏杆菌(Pasteurella Pm)是引起兔呼吸道传染病的主要致病菌，临床上这两种菌有时呈现混合感染， 由于它们在菌落形态、临床症状以及病理变化等方面都存在许多相似的地方，仅 靠表面症状容易造成误诊，所以建立一种操作简便、快速灵敏和特异性强的检测 isothermal amplification， 方法显得十分必要。环介导等温扩增(Loop-mediated LAMP)技术是Notomi等在2000年开发的一种新颖的核酸扩增技术，通过一种 DNA 链置换DNA聚合酶(Bst polymerase)的作用，在恒温条件下高效、快速、 特异地扩增靶基因，不需要PCR的热循环步骤和繁琐的电泳检测过程，为病原 在临床上的快速诊断提供了全新的思路。 本研究针对Bb16SrRNA基因和PmKmtl基因，使用在线设计软件 DNA 温度和时间、dNTPs浓度、M92+浓度、Betaine浓度、BstPolymerase浓度 以及引物浓度进行了优化，建立了LAMP反应体系。 本研究利用LAMP技术对8株兔源性细菌分别进行Bb和Pm的特异性试验， 结果显示仅有目标菌株为阳性，其余7株细菌均为阴性，表明LAMP检测技术 具有良好的特异性。 本研究采用Qiagen试剂盒法制备模板进行LAMP反应，该方法检测Bb和 的100倍。 本研究用己优化的LAMP检测方法分别对15份Bb阳性样品和10份Pm阳 性样品进行稳定性与重复性试验，检测结果均为阳性，表明该方法具有良好的稳 定性与重复性。 摘要 本研究比较了3种基因组DNA提取方法对LAMP检测结果的影响，研究结 果